Histonas H2A e enzima SET metiltransferase de Echinococcus granulosus : clonagem e expressão em Escherichia coli

A hidatidose cística é uma das 17 doenças tropicais negligenciadas, segundo a Organização Mundial da Saúde, e apresenta um caráter hiperendêmico em países da América do Sul. A zoonose é causada pelo cestódeo Echinococcus granulosus, que secreta e expõe muitas moléculas responsáveis pela modulação do sistema imunológico do hospedeiro e pelo estabelecimento/manutenção da infecção crônica. As histonas H2A de E. granulosus foram identificadas no líquido hidático e em produtos de secreção/excreção de protoescólices em cultura in vitro por análises proteômicas. Histonas ainda foram descritas em mitocôndrias e sendo capazes de fazer translocação direta através da membrana plasmática em células de mamíferos. Histonas já mostraram possuir ação antimicrobiana com envolvimento na resposta imune inata, e são potenciais candidatas para vacina em infecções por Leishmania. Proteínas secretadas tipicamente possuem uma extensão amino-terminal, denominada de peptídeo sinal, a qual é crucial para a eficiência no transporte da proteína através da membrana. Neste trabalho, primeiramente, foram realizadas buscas de sequências de peptídeo sinal e que indicassem a possível secreção de histonas e de proteínas relacionadas à modificação de histonas anotadas no genoma de E. granulosus (GeneDB, http://www.genedb.org). Foram analisadas as sequências de 71 proteínas utilizando 13 programas de predição, possibilitando a escolha de 3 proteínas-alvo para estudos experimentais: histona H2A His20607, histona H2A His9277 e SET metiltransferase. A clonagem das sequências codificadoras das proteínas His20607, His9277 e SET metiltransferase foi realizada no vetor plasmidial pGEX-TEV por recombinação homóloga in vivo, utilizando-se a cepa de Escherichia coli KC8. Foram testadas diferentes condições para a expressão das proteínas His20607, His9277 e SET metiltransferase em E. coli. A expressão das proteínas recombinantes em fusão com a proteína GST permitiu a sua purificação por cromatografia de afinidade com a resina de Glutationa-Sepharose 4B. As proteínas foram liberadas da fusão com a GST por clivagem com a protease TEV. As proteínas recombinantes serão utilizadas na caracterização do padrão de localização dessas proteínas em componentes do cisto hidático e em organelas celulares, a fim de entender melhor os locais de atuação destas proteínas no parasito e nas suas células.Cystic hydatid disease is one of 17 neglected tropical diseases, according to the World Health Organization, and is a hyperendemic infection in countries of South America. It is a zoonosis caused by Echinococcus granulosus, a cestode which secretes and exposes numerous molecules responsible for the modulation of the host immune system and for the establishment/maintenance of chronic infection. The E. granulosus H2A histones were identified in proteomic analyses of hydatid fluid and excretory-secretory product obtained from protoscoleces (pre-adult) culture. Histones were also described in mitochondria and being able to translocate across the plasma membrane of mammalian cells. Histones have been shown that they present antimicrobial activity with involvement in the innate immune response and are potential candidates for vaccine in Leishmania infections. Typically, secreted proteins have an amino terminal extension called signal peptide, which is crucial for the efficient transport of the protein through the membrane. In this work, initially, searches were performed for signal peptide sequences and sequence that indicated the possible secretion of histones and related histones modifying proteins annotated in the genome of E. granulosus (GeneDB, http://www.genedb.org). The sequences of 71 proteins were analyzed using 13 prediction programs, allowing the selection of three for experimental studies: histone H2A His20607, histone H2A His9277 and SET methyltransferase. The cloning of the coding sequences of His9277, His20607 and SET methytransferase proteins were performed on pGEX-TEV plasmid vector by in vivo homologous recombination, using Escherichia coli strain KC8. Different conditions of expression of His9277, His20607 and SET methyltransferase proteins were tested in E. coli. The expression of recombinant proteins in fusion with GST protein allowed their purification by affinity chromatography with Glutathione-Sepharose 4B resin. The proteins were released from the fusion with GST by cleavage with TEV protease. Recombinant proteins will be used to characterize the pattern of localization of these proteins in hydatid cyst components and cell organelles to provide a better understanding about the sites of action of these proteins in the parasite and its cells