Identificação das mutações mais frequentes relacionadas com a resistência a tuberculose nos genes rpoB, katG e inhA através de um método molecular de detecção colorimétrica

Tuberculose (TB) Multidroga resistente (MDR) é definida como a doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis) com resistência ao menos a isoniazida (INH) e rifampicina (RMP), sendo um crescente problema de saúde pública em todo o mundo. A escolha do tratamento da tuberculose multiresistente (MDR-TB) deveria ser baseada em testes de suscetibilidade as drogas. Estes métodos são laboriosos e demorados, sendo comum ter que aguardar até mais de quatro semanas para obtenção do resultado. Por esta razão, a maioria dos pacientes é orientado a realizar o tratamento sem um teste de susceptibilidade. A detecção precoce do bacilo, bem como a detecção de sua resistência, é crucial para um tratamento adequado, evitando a propagação de cepas resistentes na comunidade. Os métodos baseados em biologia molecular, apesar de rápidos, costumam requerer o uso de equipamentos de alto custo, como o, sequenciador ou GeneXpert MTB/RIF o que inviabiliza a sua utilização na rotina dos laboratórios públicos no Brasil. Por estas razões, objetivamos padronizar uma metodologia de hibridização molecular em membranas (LINE-TB/MDR) capaz de detectar as mutações mais frequentemente relacionadas com resistência a RMP e a INH em isolados de M. tuberculosis, as duas principais drogas utilizadas no tratamento da doença. Sondas gênicas com estas mutações, localizadas nos genes katG, rpoB e inhA , foram fixadas em membrana de náilon para hibridizar com o produto de um PCR multiplex, permitindo a detecção rápida das mutações. O método foi validado em um painel de referência de 108 amostras devidamente caracterizadas pelo teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA) e sequenciamento gênico. Quando comparado com o TSA a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo, para RMP foi 100% em todas as análises. Considerando a análise de resistência a INH, o teste obteve sensibilidade, especificidade, VPP e VPN de 77%, 100%, 100% e 82% respectivamente. Quando comparado com o sequenciamento a sensibilidade, especificidade, VPP e VPN para RMP foi de 100% para todas as análises. Para resistência a INH a sensibilidade especificidade PPV e NPV foi 94,3%, 100%, 100% e 94,8% respectivamente. O método desenvolvido poderá ser utilizado como uma alternativa para a identificação rápida de cepas multirresistentes, além de permitir a identificação do complexo M. tuberculosis.Multidrug-resistant (MDR) tuberculosis (TB), defined as the disease caused by a Mycobacterium tuberculosis strain with resistance to at least isoniazid (INH) and rifampicin (RMP), is a growing public health and clinical problem worldwide. The choice of treatment of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is often based on drug susceptibility testing (DST). Drug susceptibility testing by conventional methods takes more than 4 weeks. An accurate and early detection of drug resistance in M. tuberculosis isolates is crucial for appropriate treatment, and to prevent the development of further resistance and the spread of resistant strains. Generally, DNA sequencing-based approaches are considered the reference assays for the detection of mutations, but often they have been found to be too cumbersome for routine use. For this reason, the aim of this study was to standardize a molecular hybridization method (LINE-TB/MDR) able to detect the most frequent mutations related to resistance to RMP and INH in M. tuberculosis isolates. Specific mutations found in the genes rpoB, katg and inhA have been reported as a marker for resistance to tuberculosis first line drugs. The assay was validated on a reference panel with 108 samples well-characterized by antimicrobial susceptibility testing (AST) and DNA sequencing. When compared to AST, the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of the LINE-TB/MDR, were 100% for all analyses. For INH resistance, the sensitivity, specificity, PPV and NPV were 77%, 100%, 100% and 82% respectively. When compared with sequencing, the sensitivity, specificity, PPV and NPV of the LINE-TB/MDR, for RMP resistance, were 100% for all analyses. For INH resistance the sensitivity, specificity, PPV and NPV were 94,3%, 100%, 100% and 94.8% respectively The developed assay could be used as an alternative for rapid identification of multi drug resistant (MDR) strains, and additionally, allowing the M. tuberculosis complex identification