Produção de peptídeos antimicrobianos por Bacillus sp. P11

A produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 foi testada em diferentes subprodutos da indústria de alimentos. Farelo de soja foi o meio escolhido para determinar o efeito de três variáveis (temperatura, pH inicial e concentração do substrato) sobre a atividade antimicrobiana pela metodologia de superfície de resposta, utilizando um experimento fatorial 23. Na faixa estudada, temperatura e pH inicial do meio apresentam efeito significativo sobre a produção de atividade antimicrobiana, já a concentração do substrato não teve nenhum efeito significativo. Os dados mostraram produção máxima em pH inicial entre 7,0 e 8,5 e temperatura entre 39 e 42ºC. Nessas condições a produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 em farelo de soja foi comparada com a produção em meio de cultivo comercial (caldo BHI). Os resultados obtidos para os dois meios de cultura foram semelhantes, indicando que o farelo de soja pode ser um substrato de baixo custo para produção de antimicrobianos por Bacillus sp. P11. Para demostrar o efeito da temperatura e do pH na produção de peptídeos antimicrobianos, verificou-se a expressão de sboA (subtilosina A) e ituD (iturina A) em Bacillus sp. P11, utilizando a metodologia de qRT-PCR. A produção de subtilosina A e iturina A foi confirmada por espectrometria de massas. A expressão de sboA e ituD foi fortemente afetada pelo pH e pela temperatura e qRT-PCR provou ser uma poderosa ferramenta para investigar o potencial da cepa em produzir subtilosina A e iturina A. Além disso, a produção de peptídeos antimicrobianos por Bacillus sp. P11 foi investigada na presença de células inativadas termicamente de bactérias e fungos. A cepa exibiu maior atividade antimicrobiana na presença de células inativadas de Staphylococcus aureus ou Aspergillus parasiticus. Nessas condições a expressão de genes essenciais relacionadas com a biossíntese dos peptídeos antimicrobianos surfactina, iturina A, subtilosina A e fengicina foi investigada por qRT-PCR. Os resultados sugerem que o aumento da atividade antimicrobiana foi relacionado com a produção de iturina A, um peptídeo antimicrobiano que mostra forte atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de fungos e pode ser usado no controle biológico de doenças de plantas. Por fim, foram testadas diferentes metodologias para a purificação parcial dos peptídeos antimicrobianos produzidos por Bacillus sp. P11. Os melhores resultados foram obtidos por partição em sistema aquoso bifásico com o sal sulfato de zinco, porém estudos adicionais são necessários.Production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 was tested in different byproducts of food industry. Soybean meal was the selected medium to determine the effect of three variables (temperature, pH and substrate concentration) on the antimicrobial activity by response surface methodology, using a 23 factorial design. In the range studied, temperature and initial pH of the medium had a significant effect on the production of antimicrobial activity and substrate concentration had no significant effect. The data showed maximum production at initial pH between 7.0 and 8.5 and temperature between 39 and 42°C. Under these conditions the production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 in soybean meal was compared with the commercial medium (BHI). The results for both culture media were similar, indicating that soybean meal can be a low cost substrate for the production of antimicrobial activity of Bacillus sp. P11. To demonstrate the effect of temperature and pH on the production of antimicrobial peptides, we studied the expression of sboA (subtilosin A) and ituD (iturin A) in Bacillus sp. P11, using qRT-PCR methodology. The production of subtilosin A and iturin A was confirmed by mass spectrometry. The expression of sboA and ituD was strongly affected by pH and temperature and qRT-PCR proved to be a powerful tool to investigate the potential of the strain to produce subtilosin A and iturin A. In addition, the production of antimicrobial peptides by Bacillus sp. P11 was investigated in the presence of thermally inactivated cells of bacteria and fungi. The strain exhibited higher antimicrobial activity in presence of inactivated cells of Staphylococcus aureus or Aspergillus parasiticus. Under these conditions the expression of essential genes related to biosynthesis of antimicrobial peptides surfactin, iturin A, subtilosin A and fengycin was investigated by qRT-PCR. The results suggest that the increase in antimicrobial activity was related to the production of iturin A, an antimicrobial peptide that shows strong antimicrobial activity against a broad spectrum of fungi and can be used in biological control of plant diseases. Finally, we tested different methods for partial purification of antimicrobial peptides produced by Bacillus sp. P11. The best results were obtained by partition in aqueous two-phase system with the salt zinc sulfate, but further studies are needed