Identificação e caracterização de uma nova heme peroxidase exclusiva de plantas

Peroxidases são enzimas amplamente distribuídas nos organismos, sendo de fundamental importância para o seu desenvolvimento. Atuam reduzindo o peróxido de hidrogênio à água, minimizando, assim, o dano celular em condições de estresse e modulando as respostas celulares que utilizam o peróxido de hidrogênio como molécula sinalizadora. Através de análises em bancos de depósito de genomas, uma provável nova heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related ou APx-R) foi identificada. APx-R é uma proteína exclusiva de plantas e está presente desde organismos basais, como algas, até angiospermas. Diferentemente de outras peroxidases, geralmente codificadas por pequenas famílias gênicas originadas a partir de eventos de duplicação, APx-R se apresenta como um gene cópia-única em todos os genomas de plantas já sequenciados e disponibilizados. Apesar de haver grande similaridade de estrutura proteica entre APx e APx-R, APx-R possui um grande número de substituições conservadas em domínios críticos, sugerindo que esta proteína provavelmente se originou de algum membro da família das ascorbato peroxidases, mas acumulou mutações suficientes de forma que não pode mais ser considerado um membro desta família. Para verificar a localização subcelular de APx-R, protoplastos de arroz foram transfectados com uma construção de fusão traducional APx-R::YFP, sob o controle do promotor 35S. A visualização da florescência foi feita através de microscopia confocal e revelou que APx-R é uma proteína de dupla-localização, a qual pode localizar-se tanto nas mitocôndrias quanto nos cloroplastos. Análises de BiFC mostraram que APx-R pode interagir com as APx presentes nos mesmos compartimentos subcelulares, indicando que estas proteínas podem estar atuando de forma sinérgica no metabolismo de detoxificação do peróxido de hidrogênio. Para caracterizar APx-R funcionalmente, mutantes de arroz superexpressando RNA de interferência objetivando silenciar o gene OsAPx-R foram obtidos através de transformação via Agrobacterium tumefaciens. As plantas RNAi-OsAPx-R apresentaram alterações no metabolismo do peróxido de hidrogênio quando comparadas às plantas não-transformadas, mostrando diferenças nas atividades de SoD. Cat e APx, suportando a provável participação de APx-R na defesa contra o estresse. Assim, estes resultados mostraram que OsAPx-R codifica uma proteína funcional, a qual está relacionada com o sistema antioxidante e é requerida na resposta a estresses, provavelmente atuando na proteção dos cloroplastos e mitocôndrias, ambas organelas com intensa formação de espécies reativas de oxigênio.Peroxidases are widely distributed in all organisms, being of fundamental importance for their development. These enzymes act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cellular damage in stressful conditions and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genomic databases, a putative new heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) was identified. APx-R is exclusive of plants and present from basal to vascular organisms. Unlike other peroxidases, usually encoded by large genic families originated from duplication events, APx-R is present as a single-copy gene in all available plant genomes. Despite the high structure similarity between APx and APx-R proteins, APx-R presents a great number of conserved substitutions in critical domains, suggesting that this protein probably emerged from the family of ascorbate peroxidases, but accumulated enough mutations so it cannot be grouped in this family anymore. To access subcellular localization, rice protoplasts were transfected with a translational fusion of yellow fluorescent protein (YFP) to APx-R protein under the control of the 35S promoter. Fluorescence visualization was performed by confocal microscopy and revealed that APx-R is a dual-target protein targeted to chloroplasts and mitochondrias. BiFc analysis showed that APx-R can interact with APx proteins which are present in the same subcellular compartments, indicating that these proteins may be acting synergistically in hydrogen peroxide scavenging metabolism. To further characterize APx-R in antioxidant metabolism, rice mutants expressing interference RNA for APx-R gene were obtained through Agrobacterium tumefaciens transformation. RNAi-silenced plants presented a disturbed hydrogen peroxide metabolism in comparison to non-transformed plants, with differences in SoD, Cat and APx activity, supporting the participation of APx-R in stress defense. Altogether, these results showed that OsAPx-R encodes a functional protein, which is related to the antioxidant system and required in stress response, probably acting in chloroplast and mitochondria protection, both organelles with intense reactive oxygen species formation