Application of the essential oil of oregano (Origanum vulgare) in the treatment of bovine mastitis and fungi in fresh cow milk

O estudo objetivou identificar a presença de fungos no leite mastítico; avaliar a ação in vitro do óleo essencial de O. vulgare frente a microrganismos isolados de leite; estudar a toxicidade deste óleo e realizar ensaio clínico de preparado fitoterápico a base de óleo essencial de orégano à 3% em vacas com mastite. O levantamento fúngico foi realizado em 1499 amostras de leite de quartos mamários reagentes ao California Mastitis Test (CMT). A extração do orégano foi realizada por hidrodestilação e o óleo essencial foi analisado por cromatografia gasosa. Os testes in vitro seguiram as normas do documento CLSI M7-A6 (2005) e CLSI- M27A3 (2008) adaptadas a fitofármaco. A avaliação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) foi realizada frente a 71 bactérias isoladas de leite, dos gêneros Staphylococcus sp., Streptococcus sp. e Corynebacterium sp. e três cepas padrões. Para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) foram realizados testes frente a 35 leveduras, sendo um Trichosporon asahii, Cryptococcus laurentii e Kodamaea ohmeri e 32 do gênero Candida spp. Foi realizada análise histológica de úberes de duas vacas tratadas com produto fitoterápico e como controle gentamicina a 1,35% para avaliação da toxicidade e testes de irritação dérmica e de mucosa ocular em coelhos de acordo com OECD 404 e OECD 405, respectivamente. Seis coelhos foram testados com veículo utilizado na formulação fitoterápica e seis com veículo acrescido de 3% de óleo de orégano. Essa formulação fitoterápica foi testada em 15 quartos mamários que apresentaram reação ao CMT. O grupo controle foi tratado com gentamicina a 1,35%, constituído de 14 quartos mamários com avaliação de CMT, Contagem de Células Somáticas (CCS) e cura microbiológica através de isolamento bacteriano. Foram isolados fungos em 116 (7,74%) amostras de leite com total de 121 fungos isolados. Destes, 94 eram leveduras e 27 fungos filamentosos. Dentre as leveduras, a maioria foi do gênero Candida spp. (64). O óleo essencial de orégano apresentou como principais constituintes α-terpineno, 4-terpineol e timol. A CBM média variou de 0,23% a 2% frente a cepas isoladas de leite e de 3,17% e 0,35% frente aos padrões S. aureus e Escherichia coli e não apresentou efeito para Pseudomonas aeruginosas. Todas as amostras de leveduras foram sensíveis ao óleo de orégano nas concentrações testadas, onde a CIM e a CFM variaram de 0,0625% a 1%. As alterações encontradas na histologia dos úberes foram compatíveis com mastite. Nos testes de irritação dérmica e ocular em coelhos, houve reversão das lesões em no máximo 72h. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre os grupos de tratamento com relação ao CMT e CCS nos dias 7, 14 e 21 após tratamento. Entretanto, houve diferença estatística para a cura microbiológica em todos os dias analisados (p<0,05), em favor do grupo controle. Pode-se concluir que os fungos estão presentes no leite mastítico, que o óleo essencial de orégano testado apresentou atividade antibacteriana e antifúngica em testes in vitro e não produziu efeito toxicológico persistente, porém não foi eficiente no tratamento da mastite subclínica.The study aimed to identify the presence of fungi in mastitic milk and to evaluate the in vitro action of essential oil of O. vulgare against microorganisms isolated from milk and to study the toxicity of the oil and perform clinical trial of prepared herbal of essential oil of oregano to 3% in cows with mastitis. The survey was conducted in 1499 samples from milk reacting to the California Mastitis Test (CMT). The extraction of oregano was performed by hydrodistillation and the essential oil was analyzed by gas chromatography. In vitro tests followed the CLSI document M7-A6 (2005) and CLSI-M27A3 (2008) adapted for fitoterapic. The evaluation of the minimum bactericidal concentration (MBC) was carried out against 71 bacteria isolated from milk of the genera Staphylococcus sp., Streptococcus sp. and Corynebacterium sp. and three strains standards. To determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal fungicidal concentration (MFC) tests were performed against 35 yeasts, and one Trichosporon asahii, Cryptococcus laurentii and Kodamaea ohmeri and 32 of Candida spp. We performed histological analysis of two udders of cows treated with herbal medicine and control to gentamicin 1,35%, toxicity evaluation and tests of dermal irritation and ocular mucosa in rabbits according to OECD 404 and OECD 405, respectively. Six rabbits were tested with vehicle used in herbal formulation and six with vehicle plus 3% oil of oregano. This herbal formulation was tested in 15 mammary quarters that had reactions to CMT. The control group was treated with gentamicin at 1.35%, consisting of 14 quarters with breast assessment of CMT, Somatic Cell Count (SCC) and microbiological cure by bacterial isolation. Fungi were isolated in 116 (7.74%) milk samples with total of 121 fungal isolates. Of these, 94 were yeasts and 27 filamentous fungi. Among the yeasts, the majority was of the genus Candida spp.(64). The essential oil of oregano presented as main constituent α-terpinene, 4-terpineol and thymol. CBM average ranged from 0.23% to 2% to strains isolated from milk and 3.17% and 0.35% to the standards S. aureus and Escherichia coli and showed no effect for Pseudomonas aeruginosa. All yeast strains were sensitive to oil of oregano in concentrations, where the MIC and MFC ranged from 0.0625% to 1%. The changes found in the histology were compatible udders with mastitis. In tests of skin and eye irritation in rabbits, there was reversal of the lesions in up to 72 hours. There was no significant difference (p> 0.05) between treatment groups with respect to the CMT and SCC on days 7, 14 and 21 after treatment. However, there was statistical difference for the microbiological cure in all days analyzed (p