Identificação de genes de Azospirillum amazonense diferencialmente expressos em resposta à disponibilidade de nitrogênio

Bactérias do gênero Azospirillum possuem a capacidade de promover o crescimento vegetal através de mecanismos que não estão claramente elucidados. Contudo, essa característica é muito estudada, tendo em vista a possibilidade de utilizar esses microrganismos na agricultura em detrimento do uso indiscriminado de fertilizantes industriais, que poluem o meio ambiente. O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a fatores físico-químicos, por isso, bactérias que ocupam esse nicho possuem um aparato genético capaz de prover uma adaptação plena a este ambiente. A bactéria A. amazonense tem um genoma altamente complexo e pouco estudado. O presente trabalho isolou genes envolvidos na resposta de A. amazonense ao estresse por limitação nutricional de nitrogênio, elemento crucial para a sobrevivência, já que compõe diferentes moléculas biológicas. Um dos objetivos deste trabalho foi o isolamento de genes que codificam proteínas PII em A. amazonense, que estão envolvidas na regulação do metabolismo do nitrogênio. A. amazonense apresenta dois genes parálogos que codificam para proteínas PII, glnB e glnK. Demonstramos que ambos são regulados pela disponibilidade de nitrogênio no meio. A região promotora de glnK possui elementos típicos de genes regulados pelo sistema Ntr: quatro sítios de ligação ao fator de transcrição NtrC e um promotor dependente de σ54. Foi identificada uma seqüência que corresponde a um promotor dependente de σ70 putativo sobreposto a um sítio de ligação a NtrC. O segundo objetivo foi isolar genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa técnica é muito sensível, no entanto há poucos relatos da sua utilização em bactérias, visto provavelmente as dificuldades técnicas do trabalho com o mRNA bacteriano. Através desse procedimento, foram isolados oito genes envolvidos na resposta à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH (genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). A variedade funcional desses genes ilustra o grau de complexidade da resposta de A. amazonense à limitação nutricional de nitrogênio.Bacteria belonging to the Azospirillum genus are capable of promoting plant growth, but the mechanisms implicated in this feature are not clearly elucidated. This ability has been investigated by several research groups with the main objective of substitute the use of industrialized fertilizers by bacteria inoculation in the soil. The soil is a very dynamic enviroment, so bacteria have developed many genetic resources to survive in this environment. Azospirillum amazonense has a very complex genome and up till now is poorly analysed. This work has isolated different genes implicated in the nitrogen starvation response of A. amazonense. In the first part of this work we investigated the PII coding genes of A. amazonense, that are involved in nitrogen metabolism regulation. A. amazonense has two PII genes, glnK and glnB. Both are regulated by the nitrogen availability in the medium. The glnK regulatory region has typical elements of Ntr regulated genes: four NtrC UAS sequences (upstream activator binding site) and one σ54-dependent promoter. A putative σ70-dependent promoter, that overlaps the NtrC UAS sequence has been found. In the second part of this work we isolated nitrogen regulated genes by the Micro-RDA technique. This tecnique is very sensitive, but there are few reports of its applicability on bacterial species. This occurs probably due to the bacterial mRNA features. In our work we isolated eight nitrogen regulated genes through the micro-RDA procedure and seven of them have shown similarity to proteobacteria genes. The isolated sequences correspond to: dnaK and rpoH genes (implicated in heat shock response), relA gene (involved in stringent response), a diguanylate cyclase/phosphodiesterase gene (implicated in biofilm formation), a complex I subunit gene (electrons transport chain), glnA gene (glutamine syntethase) and gltB gene (glutamate synthase). The functional variability of these genes illustrates the complexity of the nitrogen starvation response of A. amazonense