Avaliação da capacidade de genes de Eucaliptus grandis em conferir tolerância à deficiência hídrica

Uma cuidadosa revisão bibliográfica, seguida por uma pesquisa in silico no banco de dados de expressed sequence tags (ESTs) do projeto GENOLYPTUS – Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus, foram realizadas visando identificar classes de genes potencialmente relacionadas com a resposta vegetal à deficiência hídrica em Eucalyptus grandis. Os principais clones de cDNA selecionados potencialmente codificam proteínas relacionadas com a síntese de osmólitos como prolina, sacarose, osmotina, poliaminas, desidrinas, fatores de transcrição, e genes de uma importante cascata de sinalização vegetal à deficiência hídrica. Duas classes de seqüências foram estudadas mais detalhadamente. A Sadenosil- metionina-descarboxilase (SAMDC) é uma enzima-chave na rota de síntese das poliaminas, aminas catiônicas envolvidas em vários processos celulares, inclusive na proteção das estruturas da célula em respostas a diferentes tipos de estresses. Dois grupos de ESTs foram inicialmente identificados por homologia a seqüências conhecidas de SAMDC e duas seqüências potencialmente completas de cada grupo foram selecionadas e denominadas EgrSAMDC1 e EgrSAMDC2. As seqüências deduzidas de aminoácidos de ambos os cDNAs apresentaram os dois principais domínios da enzima e uma estrutura conservada em relação a outras SAMDCs de plantas. Além da região de leitura aberta (ORF, do inglês, open reading frame) principal, os cDNAs apresentaram duas pequenas regiões codificadoras conservadas, denominadas tiny e small upstream ORFs na longa região 5’ não traduzida, relacionadas à regulação pós-transcricional dos genes. Em análises de Southern blot, foram detectados pelo menos dois fortes sinais de hibridização para cada amostra de DNA genômico de E. grandis digerido por endonucleases distintas, sugerindo a existência de (pelo menos) duas cópias genômicas de SAMDC. Por Northern blots, a presença de mRNAs para SAMDC foi detectada em folhas e caules jovens e, em menor quantidade, em tecidos vasculares de árvores adultas. Entretanto e nitidamente, a maior expressão de SAMDC em E. grandis ocorre em flores abertas. Análises quantitativas por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da DNApolimerase (qRT-PCR) com plântulas cultivadas in vitro por 4 meses, submetidas a diferentes tratamentos como ácido abscísico (ABA), ácido naftalenoacético (ANA), quinetina (KIN), cloreto de sódio (NaCl), seca, frio, luz ultravioleta (UV), ferimentos e extrato de leveduras, 9 demonstraram maior indução da expressão de EgrSAMDC2 na presença de ABA e NaCl. Também foi observada uma drástica redução na expressão deste gene, baseado nos níveis de mRNA-molde para as RT-PCRs, quando as plântulas foram expostas a UV e seca. Estes resultados indicaram que o gene EgrSAMDC2 pode estar mais relacionado à resposta vegetal à elevada salinidade, por intermédio da sinalização por ABA, do que à resposta a outros estresses ambientais ou bióticos. A segunda classe de genes identificados e analisados junto ao GENOLYPTUS como potencialmente relacionados à deficiência hídrica potencialmente codificam proteína-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs, do inglês, mitogen-activated protein kinases). MAPKs são proteínas de uma importante cascata sinalizadora, constituída por três componentes denominados MAPKKK, MAPKK e MAPK. Elas estão envolvidas na sinalização do desenvolvimento, estímulos hormonais e de estresses bióticos e abióticos. O cDNA selecionado, de aproximadamente 5 kb, representa uma seqüência imatura de mRNA (transcrito primário), no qual estão presentes dois íntrons. Nas extremidades 5’ e 3’ dos íntrons existem sítios canônicos de processamento (splicing) que indicam que o transcrito deve ser corretamente processado em um mRNA maduro. A proteína deduzida a partir da união dos éxons indica que o cDNA isolado de E. grandis potencialmente codifica uma MAPK2, com alta homologia a outras MAPKs vegetais. Além disto, a seqüência de aminoácidos representa uma proteína completa, na qual os 11 domínios conservados em MAPKs, fundamentais para o correto funcionamento da enzima, estão presentes. Análise de Southern blot indicaram que este gene está presente em cópia única no genoma de E. grandis. Em análises da expressão por qRT-PCR em plântulas submetidas aos diferentes tratamentos descritos acima, foi observado uma significativa indução da transcrição com KIN e NaCl, e uma leve indução por ABA. O tratamento com UV provocou uma drástica redução na expressão de EgrMAPK2. Este resultado fornece indícios de que este gene possivelmente esteja em envolvido em repostas a estresses abióticos.A careful bibliographical review, followed by an in silico screening of the expressed sequence tag (EST) databank of the GENOLYPTUS Project – The Brazilian Research Network on the Eucalyptus Genome, were conducted to identify genes potentially related to drought responses in Eucalyptus grandis. The main selected clones potentially encode proteins related to the biosynthesis of different osmolites such as proline, sucrose, osmotin and polyamines, dehydrines, transcription factors and genes from an important plant signaling cascade. Two gene classes were studied in more detail. S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) is one of the key regulatory enzymes in the biosynthesis of polyamines, cationic amines involved in various processes of the cell, including the protection of cellular structures in response to different stresses. Two clusters of ESTs were initially identified by homology to known SAMDC sequences and, from each of them, two full-length cDNAs were identified and named EgrSAMDC1 and EgrSAMDC2. The deduced amino acid sequences from both cDNAs showed the two main enzyme domains and a conserved protein structure in comparison to other plant SAMDCs. Besides the main open reading frame (ORF), two other tiny and small upstream ORFs were found in the long 5’ non-translated region of the cDNAs. These sequences are known to be associated with post-transcriptional regulation. Southern blot analysis resulted in two strong hybridization signals for each genomic DNA digested with different restriction enzymes, indicating (at least) two SAMDC genomic copies. Northern blots detected SAMDC mRNAs in young leaves and stems and a lower transcript level in vascular tissues from mature trees. Nevertheless, the highest levels of E. grandis SAMDC steady-state mRNA was clearly detected in opened flowers. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) with total RNA from 4-months old in vitro seedlings subjected to different treatments, such as abscisic acid (ABA), naphthaleneacetic acid (NAA), kinetin (KIN), sodium chloride (NaCl), drought, cold, ultraviolet light (UV), wounding and yeast extract, demonstrated higher expression induction of EgrSAMDC2 gene with ABA and NaCl. A drastic reduction in gene expression was observed after UV and drought treatments of the seedlings, based on RNA-template levels for RT-PCRs. These results suggested that 11 EgrSAMDC2 gene might be more related to plant response against high salinity, possibly via ABA signaling, than to other environmental or biotic-like stress responses. The second gene class identified and analyzed in the GENOLYPTUS, as potentially involved in drought responses, encodes a mitogen-activated protein kinase (MAPK). MAPKs proteins are part of an important signaling casacade, which consists of three components, MAPKKK, MAPKK and MAPK. They are associated to developmental signaling, hormonal and biotic and abiotic stimuli. The selected cDNA, of about 5 kb in length, represented an immature mRNA (primary transcript) with two non-spliced introns. The canonical 5’ and 3’ splicing sites suggested that the transcript might probably be correctly translated to a mature mRNA. The deduced protein from the union of all three exons indicated that the isolated E. grandis cDNA potentially encodes a MAPK2, with high homology to other plant MAPKs. Moreover, the amino acid sequence represented a complete protein, with all 11 domains conserved in MAPKs and known to be fundamental for the enzyme functionality. Southern blot analysis indicated that EgrMAPK2 is encoded by a single genomic copy in E. grandis. From qRT-PCR expression analysis, conducted with the same plant material described above, we observed a significant transcription induction with KIN and NaCl, and a weaker induction by ABA. The UV treatment resulted in a drastic reduction of EgrMAPK2 expression. This result strongly indicated that this gene is most probably involved in abiotic stress responses