Caracterização molecular de cepas de Listeria monocytogenes de casos clínicos e alimentos no Brasil

Listeria monocytogenes é um bacilo gram-positivo, intracelular facultativo, transmitido por alimentos, que pode causar doença, a listeriose, em indivíduos susceptíveis. Embora rara, a listeriose tem grande importância para a saúde pública pela sua alta letalidade. Este trabalho teve como objetivo, identificar marcadores moleculares para utilização no desenvolvimento de nova técnica de diagnóstico molecular da listeriose. Os estudos envolveram sorotipagem, tipagem molecular pela amplificação das sequências 23S, 16S-23S e RAPD, pesquisa de plasmídios e de genes de virulência (inlA, inlB, inlC, inlJ, hly, iap, plcA, actA) em 135 cepas de L. monocytogenes de casos humanos e alimentos isoladas no Brasil no período de 1975 a 2001; infecção experimental em camundongos com cepas portando ausência ou alterações em genes de virulência; e a caracterização de isolados de um caso de endocardite atendido numa unidade de emergência cardiológica em Recife, PE, em 2010. Nenhuma relação foi encontrada entre a origem das cepas, sorotipos, perfis genéticos, conteúdo plasmidial e distribuição dos genes de virulência. Os ensaios de infecção experimental em camundongos também não permitiram estabelecer uma relação entre a presença dos marcadores de virulência considerados no estudo e as respostas dos animais inoculados. Seis isolados de hemocultura de um caso de endocardite com identificação presuntiva de Listeria spp. foram classificados como L. monocytogenes sorotipo 4b pela amplificação por PCR dos genes 23S, lmo2243 e ORF2210 específicos do gênero Listeria, espécie L. monocytogenes e sorotipo b respectivamente. Todos os genes de virulência pesquisados foram detectados por PCR nas amostras e a análise do perfil de amplificação da sequência 16S-23S revelou que os seis isolados são uma mesma cepa. Embora esses estudos não tenham revelado nenhum marcador molecular de patogenicidade, a alta frequência de genes de virulência observada entre cepas dos sorotipos mais patogênicos (1/2a, 1/2b, 4b) evidencia o potencial patogênico nas cepas brasileiras de L. monocytogenes e a necessidade de incrementar a vigilância e diagnóstico dessa bactéria. Considerando a prevalência dos sorotipos 1/2a, 4b nas amostras clinicas e dos sorotipos 1/2a, 1/2b, 4b em alimentos, desenvolvemos e padronizamos um procedimento baseado em LAMP (loop-mediated isothermal amplification) para identificação desses sorotipos. A técnica é rápida e de fácil operacionalização, utiliza um bloco de aquecimento ou banho-maria e o produto da reação pode ser visualizado a olho nu mediante adição de reagentes fluorescentes. O procedimento padronizado mostrou-se sensível, capaz de detectar 100pg de DNA ou 104 UFC, e espécie - específica, capaz de diferenciar L. monocytogenes de espécies intimamente relacionadas geneticamente. Outros sorotipos intimamente relacionados (3a, 3b, 4e e 4d) foram amplificados sem detrimento da técnica porque são raramente encontrados em amostras humanas e animais. A técnica LAMP se apresenta como uma alternativa fácil e rápida para diagnóstico e tipagem de L. monocytogenes especialmente para os programas de vigilância e investigação epidemiológica