Mecanismos moleculares das proteínas acessórias NEF e VPU relacionados à patogênese do HIV-1

A modulação de CD4 é uma das principais características da infecção por HIV e Nef desempenha um papel importante neste processo. Foi observada uma clara relação entre a degradação do receptor viral CD4, com o aumento da infecciosidade e a replicação viral, sugerindo a participação deste fenômeno na patogênese e progressão da infecção. No entanto, os mecanismos envolvidos na internalização e degradação de CD4 mediada por Nef não são totalmente compreendidas e diferentes proteínas celulares têm sido apontadas como importantes parceiros celulares de Nef. Nef agiria na superfície celular como um conector da cauda citoplasmática da molécula CD4, com membros do complexo adaptador heterotetramérico de clatrina, redirecionando a molécula CD4 para vesículas endocíticas. Uma bomba de prótons vacuolar (V-ATPase) e a proteína Epsn15 foram envolvidas no aumento da força de ligação Nef e a subunidade μ2 de AP-2. Com a finalidade de evitar a reciclagem de CD4 para a superfície celular, uma segunda conexão entre CD4 e a proteína β-COP é estabelecida por Nef, o que permitiria direcionar o receptor para degradação lisossômica. Adicionalmente, duas proteínas foram também envolvidas no mecanismo a tioesterase humana II (hTE-II/AcoT8) e a dinamina 2 (Dyn2). Entretanto experimentos para validar a relevância fisiológica dessas proteínas não foram conclusivos. Neste trabalho, pretendemos determinar a relevância fisiológica das proteínas: AP1, AP2, AP3, VH1 ATPase vacuolar, β-COP e AcoT8, na modulação de CD4 mediada por Nef, em linhas de células T e linfócitos T CD4+ de sangue periférico, infectados pelo HIV-1 . Primeiramente, análises de FRET-FACS entre alelos de Nef e as proteínas celulares apresentaram diferentes níveis de interação. O receptor CD4 mostrou variáveis níveis de interação com os alelos de Nef, NA7, NL4.3 e Mac239 (39%, 15% e 13%, respectivamente) e uma forte interação com as proteínas Ap2, β-COP (50,4%, 32% respectivamente). Por outro lado os alelos de Nef mostraram interagir principalmente com Ap2, β-COP e AcoT8, este ultimo apenas com o alelo NA7. Experimentos de microscopia confocal confirmaram os resultados obtidos por FACS-FRET mostrando em alguns casos alterações claras na localização subcelular destas proteínas. Finalmente, o silenciamento da expressão endógena das proteínas celulares na linha de célula T SupT-1 e em linfócitos primários CD4+ mostrou a proteína AP2 como sendo necessária e suficiente para a modulação de CD4 mediada por Nef. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACTDown-modulation of CD4 is one of the hallmarks of HIV infection and Nef plays a major role in this process. Has been observed a clear relation between the CD4 viral receptor degradation with the infectivity and viral replication, which suggest the high relevance of this mechanism during the pathology and infection progress. However, the exact mechanisms governing Nef mediated internalization and degradation of CD4, are incompletely understood and different cellular proteins have been suggested as key players. Nef would act on the cell surface as a connector in cytoplasmic tail of CD4 molecule with members of heterotetrameric clathrin adapter complex, redirecting the CD4 molecule for endocytic vesicles. Vacuolar proton pump (V-ATPase) and Epsn15 protein would be involved enhancing the strength binding of Nef on subunit μ2 of AP-2. In order to avoid recycling of CD4 to the cell surface, a second connection between CD4 and β-COP is established by Nef protein, which would direct the receptor to lysosomal degradation. Additionally, two proteins were also involved in the mechanism human thioesterase II (hTEII/AoT8) and dynamin 2 (DYN2). However experiments to validate the physiological relevance of these proteins were not conclusive. In this work, we aim to address the physiological relevance of AP1, AP2, AP3, VH1 vacuolar ATPase, β-COP and AcoT8 for Nef mediated down-modulation of CD4 receptor in T-cell lines, and infected primary isolated CD4 positive cells. First, FRET-FACS analyses with different Nef HIV-1 strains showed different levels of interaction. The receptor CD4 shown variable level of interaction with Nef alleles; NA7, NL4.3 and Mac239 (39%, 15% e 13%, respectively) and a strong interaction with Ap2, β-COP (50,4%, 32% respectively). On other hand, the alleles shown interacts mainly with Ap2, β-COP, and AcoT8 (only with NA7 alleles). Confocal microscopy experiments confirmed FACS-FRET results showing clear changes in subcellular localization of these proteins. Finally, endogenous cellular proteins knock-down experiments by RNA interference in transduced SupT1 and primary lymphocyte CD4+ cells showed AP2 protein as being necessary and sufficient for Nef CD4 down-modulation