Modulação do inflamassoma por componentes de cápsula secretados pelo Cryptococcus neoformans

O Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico humano que afeta majoritariamente indivíduos imunossuprimidos. Ele é o agente causador da meningite criptocócica e tem como principal fator de virulência uma cápsula polissacarídica que recobre sua parede celular. Os componentes desta cápsula estão envolvidos em diversos mecanismos de escape e de supressão da resposta imune desenvolvidos pelo fungo, o que leva a uma resposta não adequada da imunidade inata frente à infecção com consequente disseminação do patógeno. Dentre estes componentes, a glucoronoxilomanana (GXM) se destaca devido à grande variedade de modulações que a mesma é capaz de exercer em diversos tipos celulares. Neste trabalho, demonstramos uma nova interação entre estes componentes capsulares secretados e macrófagos: a inibição da secreção de IL-1β e da piroptose em macrófagos previamente ativados. Primeiramente verificamos que estes componentes possuíam a capacidade de inibir a produção de IL-1β, sem interferir na ativação fornecida pelo primeiro sinal – necessária para a produção da dada citocina. Caracterizamos parcialmente a molécula responsável por esta inibição, chegando a uma molécula pequena (menor que 1kDa), resistente ao calor (121 °C) e polar. Também verificamos que a piroptose dos macrófagos estimulados era prevenida por estes componentes capsulares, confirmando a interferência na via do inflamassoma destas células. Posteriormente realizamos ensaios para definir o mecanismo de ação pelo qual esta interferência estava ocorrendo. Verificamos que existiam depósitos da citocina intracelular pró-IL-1β e também que a enzima caspase-1 estava ativada nos macrófagos em contato com os componentes capsulares do C. neoformans. Por último, realizamos ensaios de interação entre os macrófagos e leveduras de C. neoformans, observando uma replicação intracelular exacerbada do fungo nas células tratadas com os componentes capsulares. Estes resultados demonstram a presença de uma molécula com caráter anti-inflamatório, acrescentando mais um mecanismo de modulação ao já extenso arsenal de fatores de virulência expressos pelo C. neoformans. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACTCryptococcus neoformans is a human pathogenic fungus that affects mainly immunocompromised individuals. It is the causative agent of the cryptococcal meningitis and it´s major virulence factor is a polysaccharide capsule that covers it´s cell wall. The components of this capsule are involved in various mechanisms of evasion and suppression of the immune response developed by the fungus, which leads to an inadequate answer of the innate immunity to the infection and consequent dissemination of the pathogen. Among these components, the glucuronoxylomannan (GXM) stands out due to the great variety of modulations that it is able to perform in several cell types. In this study, we demonstrated a novel interaction between these capsular components secreted by the fungus and macrophages: the inhibition of IL-1β secretion and pyroptosis in previously stimulated macrophages. First, we verified that these components had the ability to inhibit the production of IL-1β without interfering in the activation led by the first signal – necessary for the production of this given cytokine. Then we partially characterized the molecule responsible for this inhibition, discovering that it was a small molecule (smaller then 1kDa), heat resistant (121 °C) and polar. We also found that the pyroptosis was being prevented in the stimulated macrophages, confirming the interference in the inflammasome pathway of these cells. Later we performed tests to define the mechanism of action by which these interferences were occurring. We found deposits of the intracellular cytokine pro-IL-1β and also activated caspase-1 enzyme in macrophages that were in contact with C. neoformans capsular components. Ultimately, we performed interaction tests between macrophages and yeast cells of C. neoformans, observing an exacerbated intracellular growth of the fungus inside the cells treated with the capsular components. These results demonstrated the presence of a molecule with anti-inflammatory character, adding another modulatory mechanism into the already extensive arsenal of virulence factors expressed by the C. neoformans