Desenvolvimento de nanopartículas poliméricas à base de quitosana para liberação sustentada de hormônios Adeno-hipofisários e avaliação de seus efeitos in vitro na reprodução animal

A superestimulação ovariana em bovinos é uma técnica caracterizada pelo aumento do número de folículos ovarianos que continuam o seu crescimento até à ovulação. Essa técnica consiste na administração de múltiplas injeções de hormônios gonadotrópico para manter o crescimento folicular, e com a finalidade de buscar novas formas de aplicações para diminuição do custo e do manejo dos animais o estudo in vitro apresenta-se como o passo inicial. A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos compreende de três etapas, a maturação dos oócitos, a fecundação e o cultivo embrionário, sendo muito utilizada para fins econômicos e de pesquisa. O presente estudo visa ao desenvolvimento de micro e nanopartículas poliméricas para entrega sustentada, em sistemas de PIV, de hormônios adeno-hipofisários com o intuito de testar as suas atividades na expansão das células do cumulus. Após análise de produtos comerciais que oferecem atividade de FSH, por meio de espectrometria de massa MALDI TOF/TOF, a proteína precursora do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) foi identificada em algumas frações. Portanto, foi realizada sua síntese manualmente, pelo método da fase sólida, e purificação em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e, em uma etapa subsequente foi realizada uma avaliação do papel do ACTH não encapsulado na maturação in vitro de oócitos bovinos. Posteriormente, foram formuladas nanopartículas (NPs) de quitosana pelo método de geleificação iônica para encapsular o ACTH e hormônio folículo estimulante (FSH). As NPs apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 85 nm (ACTH) e de 159 nm (FSH), potencial Zeta de 51,83±1,67 mV (ACTH) e 48,5±5,41 mV (FSH) onde se obteve eficiência de encapsulamento de 30% (ACTH) e 60% (FSH). A microscopia de forma atômica (MFA) possibilitou uma avaliação qualitativa no que diz respeito à morfologia das NPs, onde as contendo ACTH apresentaram formatos variados e pequenos aglomerados, enquanto que as contendo FSH, formato aproximadamente esférico sem aglomerados. As NPs contendo FSH apresentaram atividade semelhante ao hormônio livre mesmo com 40% a menos do ativo, enquanto as ACTH-NPs não foram ativas sobre a maturação in vitro de oócitos bovinos. No que se refere à fecundação, a taxa de clivagem e de produção de blastocistos foi satisfatória apenas com as FSH-NPs. Conclui-se que as NPs contendo FSH são efetivas no processo de PIV de embriões bovinos, provendo a expansão das células do cumulus e a produção de blastocistos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe ovarian superstimulation in bovine is a technique characterized by an increase in the number of ovarian follicles which continue their growth until ovulation. This technique consists of administering multiple injections of gonadotropin hormones to maintain follicular growth, and in order to pursue new forms of applications to decrease the cost and handling of animals the in vitro study is presented as an initial step. In vitro production (PIV) of bovine embryos comprises three steps, oocyte maturation, fertilization and embryo culture, commonly used for economic and research purposes. This study aims at the development polymeric micro-and nanoparticles for sustained delivery in vitro production systems, hormones of the pituitary in order to test their activities in the expansion of cumulus cells. After analyzing the commercial product Folltropin-V that provides FSH activity through of MALDI TOF/TOF mass spectrometry, the adrenocorticotropic hormone (ACTH) was identified in some fractions. Therefore, its synthesis was performed manually by the solid phase method and following purification by reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), and in a subsequent evaluation step it was investigated the role of ACTH unencapsulated on bovine oocytes maturation in vitro. Subsequently, chitosan NPs were formulated by the ionic gelation method in order to encapsulate both adrenocorticotropic hormone (ACTH) and follicle stimulating hormone (FSH). The NPs presented a mean hydrodynamic diameter of 85 nm (ACTH) and 159 nm (FSH), Zeta potential of 51,83±1,67 mV (ACTH) and 48,5±5,41 mV (FSH) in which was obtained encapsulation efficiency of 30% (ACTH) and 60% (FSH). The atomic form microscopy (AFM) allowed a qualitative assessment with regard to the morphology of NPs where the ACTH containing showed various shapes and small agglomerates, whereas FSH, shape approximately spherical without agglomerates. NPs containing FSH showed similar activity to that of the free hormone with 40% less active, whereas ACTH-NPs were not active on the in vitro maturation of bovine oocytes. With regard to fertilization, cleavage rate and blastocyst production were satisfactory only in the case of FSH-NPs. We conclude that NPs which contained FSH are effective in the PIV bovine embryos, providing the expansion of the cumulus cells and producing blastocysts