Análise proteômica da fração nuclear de formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma parasitose de grande relevância na América Latina. A divisão celular do T. cruzi possui características incomuns à maioria dos eucariotos, dado que durante o processo não ocorre o desaparecimento da membrana nuclear e condensação de seus cromossomos. O objetivo deste trabalho foi o estudo do conjunto de proteínas (proteoma) presentes no núcleo da forma epimastigota do T. cruzi. Para tanto, lisados celulares do parasito foram submetidos a um fracionamento celular por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. O enriquecimento nuclear foi validado por microscopia de fluorescência com marcação para DNA e as imagens comparadas com a microscopia de campo claro, mostrando que a fração nuclear foi obtida com alto grau de pureza. A análise por SDS-PAGE mostrou diferenças evidentes de perfil proteico entre o extrato nuclear e extratos das demais frações obtidas durante o fracionamento. As proteínas do subproteoma nuclear foram posteriormente analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE) e por digestão tríptica seguida de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Usando esta última abordagem foi identificadas mais de 800 proteínas sendo quase 30% hipotéticas. Dentre os principais processos biológicos encontrados para as proteínas identificadas estão processos catabólicos, biossintéticos, geração de metabólitos e energia, processo metabólicos nucleares e tradução. As proteínas encontradas poderão ser alvos de futuros estudos para a elucidação de processos como divisão celular, transcrição gênica e formação de cromossomos, que hoje ainda não são bem elucidados. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe Trypanosoma cruzi is a protozoan that causes Chagas´ disease, a disease of great relevance in Latin America. The replication process of the T. cruzi possesses unusual features, when compared to other eukaryotes; given that during this process, the nuclear membrane does not disappear and there is not chromosome condensation. The goal of this project was to study the set of proteins (proteome) that are present in the nucleus of the T. cruzi epimastigote life form. To this end, the parasite cell lysates were subjected to cell fractionation by sucrose gradient ultracentrifugation. As a way to validate these purity of the isolated cell fractions, we used optical microscopy methods including bright field analysis and fluorescence microscopy after DNA labeling. The images demonstrated that the nuclear fractions were obtained with high purity. Furthermore, SDS-PAGE analysis showed differences in protein profiles between the nuclear extracts and extracts of other fractions obtained during the fractionation. The proteins of the nuclear subproteome were subsequently analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Using the latter approach, we identified more than 800 proteins with almost 30 % being hypothetical. Among these proteins many are involved in important biological processes such as catabolic and biosynthetic pathway, metabolites and energy generation, nuclear metabolites and translation. Hence, the proteins describe in this work may be use in future studies to elucidate processes such as cell division, transcription and chromosomes packaging, which are not fully well understood