Effects of prolonged in vitro culture, cryopreservation and use of chromatin modifying agents on amniotic fluid and umbilical cord cells from bovine fetuses for use in nuclear transfer

Apesar de todo o potencial para o uso da transferência nuclear (TN) em bovinos, vários parâmetros continuam limitantes para a melhor eficiência da técnica. Considerando essas limitações, este trabalho propõe o uso de modelos celulares que não passaram pela gastrulação, sob influência do cultivo in vitro por longos períodos e diferentes formas de criopreservação. Em seguida, o melhor tipo celular para a produção de embriões por TN e foi avaliado sob o efeito de tratamentos que otimizem reprogramação nuclear. Células do fluido amniótico (CFA) e do cordão umbilical (CCU) foram utilizadas em comparação aos fibroblastos da orelha (CFO) e foram submetidos ao cultivo celular por 20 passagens e criopreservação em diferentes soluções contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), 5% de dimetilformamida e 7% de glicerol. A viabilidade celular, ultraestrutura, fragmentação do DNA e estabilidade cromossomal foram avaliadas para determinar o tipo celular mais resistente. Em todos os animais, foi possível avaliar as CFA e CCU por 20 passagens com diferentes tempos de crescimento celular para atingir a fase de confluência. As soluções com 10% de DMSO garantiram a viabilidade de 90,33±5,58%, 90,56±4,40% e 81,90±3,31%, respectivamente para CFO, CCU e CFA, sendo significativamente mais eficiente e com menor variação para preservação que as outras soluções crioprotetoras. Não houve alterações no cariótipo e houve baixa fragmentação nuclear ao longo das passagens estudadas. Na avaliação ultraestrutural, as CFA se mostraram mais sensíveis à criopreservação em relação às CCU e CFO, e apresentaram uma baixa viabilidade em P20 (17,2± 8,87%). A partir deste experimento, as CCU foram usadas na TN e submetidas a três atamentos: (T1) CCU foram tratadas com 1,5 mM de procaína por dois ciclos de crescimento; (T2) tratadas com 50 nM de tricostatina A (TSA) por 4h na ativação e 20 h no cultivo embrionário; (T3) tratadas com 50 nM de TSA por 4 h na ativação e 16 h no cultivo embrionário. Todos os tratamentos foram comparados com o grupo sem tratamento (controle). O tratamento com procaína provocou alterações na morfologia e teve baixa produção de blastocistos (4,4%). O tratamento com TSA por 24 h teve baixa produção de blastocistos (4,5%) e foi significativamente diferente da TSA 20 h e do controle. O tratamento por 20 h (17,19%) viabilizou o uso da TSA, mas não foi superior ao controle (21,73%). Os resultados demonstram que, em bovinos as CFA e CCU podem ser isoladas, cultivadas in vitro e criopreservadas em 10% de DMSO, apresentando estabilidade cromossomal e baixa fragmentação nuclear, sendo que as CCU são mais resistentes que as CFA. O uso de 1,5 mM de procaína e de 50 nM de TSA por 24 h não foram viáveis na produção de embriões por TN. Porém, o uso de 50 nM TSA por 20 h não comprometeu a produção de blastocistos produzidos por TN. No entanto, concentrações e tempo de exposição ao TSA diferentes devem ser testados para aumentar a produção embrionária e o nascimento de bezerros saudáveis. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTDespite all the potential of animal cloning by nuclear transfer (NT), some parameters still limit the efficiency of this technique. Considering these limitations, the objective of this work was to study the cellular types that did not participated in the gastrulation process, in conditions of long-term culture and cryopreservation with different solutions. We also studied the potential of these cell types to produce embryos by NT when recontructed zygotes were treated with substances to optimize nuclear reprogramming. Amniotic fluid cells (AFCs) and umbilical cord cells (UCCs) were used in a comparative study with ear fibroblast cells (EFCs) that were cultured in vitro until 20 passages and cryopreserved in 10% Dimethyl sulfoxide (DMSO), 5% Dimethyl formamide and 7% Glycerol solutions. The cellular viability, ultrastructure, DNA fragmentation and chromosome stability were evaluated to determine the most resistant cellular type. In all animals, it was possible to evaluate the AFCs and UCCs until 20 passages with different periods of cellular growth to reach the confluence phase. Solutions containing 10% DMSO ensured viability of 90.33±5.58%, 90.56 ±4.40% and 81.90±3.31%, respectively for EFCs, AFCs and UCCs, being significantly more efficient and with less variation than other cryoprotectant solutions. There was no changes in karyotype and nuclear fragmentation was low at the cellular passages studied. In the ultrastructural evaluation, AFCs were more sensitive to cryopreservation than UCCs and EFCs and presented low viability rate at P20 (17.2±8.87%). From these results, the UCCs were used in the NT and submitted to three treatments: (T1) UCCs were treated with 1.5 mM procaine in two growth cycles; (2) reconstructed oocytes treated with 50 nM of trichostatin A (TSA) for 4 h in the activation phase and for 20 h in embryo development; (3) reconstructed oocytes treated with 50 nM TSA for 4 h in the activation phase and for 16 h during initial embryo culture. All treatments were compared with the untreated group (control). Treatment with procaine caused changes in cellular morphology and resulted in low blastocysts rate (4.4%). Treatment with TSA for 24 hours had low blastocyst production (4.5%) and was significantly different from the control and TSA 20 h treatment. The treatment for 20 hours made feasible the use of TSA (17.19% of blastocysts), but was not superior to the control group (21.73%). The results demonstrate that in bovine, AFCs and UCCs can be isolated, cultured in vitro and cryopreserved in 10% DMSO, not causing damage to DNA and chromosomes. The UCCs were more resistant than AFCs in all aspects. The use of 1.5 mM procaine and 50 nM TSA for 24 hours was not viable for NT embryos production. However, the use of 50 nM TSA for 20 hours did not compromise the blastocysts production, but different concentrations and times of exposure to TSA should be tested to enhance bovine NT embryo production and birth of healthy calves