Genômica comparativa de isolados de Condylorrhiza vestigialis MNPV com ênfase no seu provável locus v-cath/chiA e caracterização de clones purificados e mutantes FP gerados

O lepidóptero Condylorrhiza vestigialis é uma das principais pragas desfolhadoras da cultura de álamo no Brasil. Como uma alternativa de controle desta praga, o baculovírus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) vem sendo aplicado em plantações de Álamo na região de Cascavel-PR. Devido à ocorrência no campo de lagartas mortas por infecção viral apresentando tegumento liquefeito e intacto, os genes virais catepsina (v-cath) e quitinase (chiA), essenciais para a liquefação do tegumento da lagarta morta por vírus, foram investigados quanto a sua presença ou ausência nos genomas de dois isolados de campo de CoveMNPV. A amplificação destes genes por PCR usando oligonucleotídeos degenerados foi altamente inespecífica em ambas as amostras. Embora os produtos detectados em gel de agarose fossem dos tamanhos esperados, as suas sequências não corresponderam aos genes v-cath e chiA, indicando uma possível ausência desses genes no genoma de CoveMNPV. Bioensaios demonstraram um comportamento semelhante para ambas às amostras de campo, onde à maioria das lagartas mortas apresentou o tegumento íntegro. Os perfis de restrição do DNA viral, gerados pela clivagem com cinco endonucleases de restrição (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII e PstI), foram idênticos para ambos os isolados, tanto para bandas principais como submolares. Para melhor entender as diferenças nos dois isolados de campo de CoveMNPV, seus genomas foram sequenciados utilizando o sequenciador automático FLX 454 (Roche). Após a montagem, anotação e análise, os dois isolados foram comparados por meio da avaliação de polimorfismos, onde o percentual de similaridade entre eles foi de 99.97%. O genoma do CoveMNPV é de 125.767 pares de base (pb) e tem um conteúdo G+C de 42.9%, e contém 138 fases abertas de leitura (ORFs), 9 bros e 4 hrs. Análise filogenética baseada nas sequências deduzidas de aminoácidos do genoma completo e nas sequências nucleotídicas de 11 genes comuns a todos os baculovírus (core genes) classificou o CoveMNPV como espécie irmã do clado AgMNPV/CfDEFMNPV. A ausência dos genes v-cath e chiA foi confirmada no genoma de ambos os isolados, e análise filogenética do locus lef-7/gp64 sugere que este evento tenha ocorrido no ancestral do AgMNPV, CfDEFMNPV e CoveMNPV. Com base na presença de bandas submolares no perfil de restrição do DNA dos isolados de CoveMNPV, clones virais foram purificados por plaque assay a partir de uma das misturas de genótipos de campo. Três destes clones, nomeados CoveMNPV-C2, -C6 e -C8, foram selecionados e amplificados in vivo e in vitro. Análise comparativa dos DNAs não mostrou qualquer alteração entre os perfis de restrição gerados por BstEII, HindIII e PstI, sugerindo a não recuperação do genótipo de campo após a primeira passagem dos clones in vivo. Os clones foram submetidos a ensaios de infectividade in vivo e in vitro, evidenciando diferenças nos seus graus de virulência. Além disto, os OBs dos clones demonstraram diferenças na morfologia do poliedro como revelado por microscopia eletrônica de transmissão. Com base nestes dados, os genes polh e fp25k responsáveis pela formação do poliedro, antes e após a passagem dos clones in vivo, foram amplificados e sequenciados. Nenhuma alteração no gene polh foi detectada, mas o gene fp25k do C8 e C6 apresentou uma mutação frameshift pela inserção de um único nucleotídeo resultando em uma proteína truncada. Após a passagem destes clones in vivo houve uma diminuição na frequência do mutante com relação ao selvagem. Os OBs do C8 apresentaram poucos ou nenhum ODV no seu interior, fenótipo este esperado para um fp25k mutado, e o que também justifica sua menor virulência observada em ensaios in vivo. O clone que se mostrou mais virulento em ensaios in vivo, CoveMNPV-C2, foi similar ao isolado de campo após passagem in vitro, não mostrando qualquer mutação no gene fp25k e produzindo ODVs oclusos. Estas evidências sugerem que este clone é geneticamente mais estável, uma vez que não houve alteração em consequência da passagem em cultura de células, enquanto que os outros clones foram identificados como mutantes de poucos poliedros (FP: few polyhedra). _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe lepidopteran, Condylorrhiza vestigialis is a major defoliating pest of poplar in Brazil. The baculovirus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) has been applied in poplar plantations in the region of Cascavel-PR as an alternative to chemical control of this pest. Due to the occurrence of dead caterpillars in the field with either intact or liquefied integument, the presence or absence of virus-encoded cathepsin (v-cath) and chitinase (chiA) genes, essential for the liquefaction of the integument of caterpillars killed by virus, were investigated in the genomes of two CoveMNPV field isolates. Amplification of these genes by PCR using degenerate primers was highly nonspecific in both samples. Although some products detected by agarose gel electrophoresis were of the expected sizes, their sequences did not correspond to the v-cath and chiA genes, indicating a possible lack of these genes in the CoveMNPV genome. Bioassays showed a similar behavior for both field samples, where most killed caterpillars possessed an intact integument. The restriction profiles of the viral DNA, generated by cleavage with five restriction endonucleases (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII and PstI), was identical in the two isolates, for both major and submolar bands. To better understand the differences in the two CoveMNPV field isolates, their genomes were sequenced using the 454 FLX automated sequencer (Roche). Following assembly, annotation and analysis, the two genomes were compared to evaluate polymorphisms, where the percentage similarity between them was 99.97%. The CoveMNPV genome is 125,767 base pairs (bp) and has a G+C content of 42.9%, and contains 138 open reading frames (ORFs), 9 bros and 4 hrs. Phylogenetic analysis based on deduced amino acid sequences of the complete genome and nucleotide sequence of 11 core genes placed CoveMNPV as sister to AgMNPV and CfDEFMNPV. The absence of v-cath and chiA genes was confirmed in the genome of both isolates, and phylogenetic analysis of the lef-7/gp64 locus suggests that this event occurred in the ancestor of AgMNPV, CfDEFMNPV and CoveMNPV. Based on the presence of submolar bands in DNA restriction profiles of CoveMNPV isolates, viral clones were purified by plaque assay from a mixture of field genotypes. Three of these clones, named CoveMNPV-C2, -C6-and -C8, were selected and amplified in vivo and in vitro. Comparative DNA analyses showed no change in the restriction profiles generated by BstEII, HindIII and PstI suggesting the no recovery of field genotype after the first passage of the clones in vivo. The clones were also subjected to in vivo and in vitro infectivity assays, showing differences in their degree of virulence. Furthermore, the OBs of the clones also demonstrated differences in polyhedron morphology as revealed by transmission electron microscopy. Based on these data, the polh and fp25k genes responsible for polyhedron formation, before and after passage of the clones in vivo, were amplified and sequenced. No change in the polh gene was detected, but the fp25k gene of C8 and C6 showed a frameshift mutation by insertion of a single nucleotide resulting in a truncated protein. After the passage of these clones in vivo there was a decrease in the frequency of the mutant relative to the wild-type. The OBs of C8 had few or no ODVs inside, which is the expected phenotype for an fp25k-defective mutant, and also explains its lower observed virulence in in vivo assays. The clone showing greater virulence in in vivo assays, CoveMNPV-C2, was similar to the field isolate after passage in vitro, did not show any mutation in the fp25k gene and produced occluded ODVs. This evidence suggests that this clone is genetically more stable, since it did not change as a result of passage in cell culture, whereas other clones were identified as few polyhedra (FP) mutants