Descoberta e análise da variabilidade interespecífica de pequenos RNAs via sequenciamento de nova geração em Eucalyptus

Há pouco mais de uma década foi descrita a função de mais uma classe de elementos regulatórios chamados de micro RNAs - miRNAs. Inicialmente descritos como reguladores pós transcricionais envolvidos no processo desenvolvimento, estes já tiveram papel validado em uma ampla gama de processos como germinação, determinação de morfologia e respostas a estresse biótico e abiótico. A descrição desta classe de reguladores em Eucalyptus contribui com o conhecimento científico deste importante e vasto gênero inserindo mais um relevante elemento na anotação do recente genoma de referência de Eucalyptus grandis. Para a identificação em escala genômica de miRNAs em Eucalyptus, foi realizado um sequenciamento de pequenos RNAs em larga escala em amostras de folha e xilema em desenvolvimento nas duas principais espécies plantadas do gênero - E. grandis e E. globulus. Com o objetivo de otimizar o processo de descoberta de locos de pequenos RNAs, as amostras de folha e xilema de E. grandis usadas no sequenciamento foram da mesma árvore BRASUZ1, usada no sequenciamento do genoma de referência de Eucalyptus. O sequenciamento permitiu, além da descoberta de pequenos RNAs, uma análise da variabilidade interespecífica pelo mapeamento das sequências de ambas as espécies contra o genoma de E. grandis. A caracterização in silico das sequências obtidas com o sequenciamento obedeceu a uma sequência de passos iniciada pela busca, por similaridade de sequência, visando a identificação de sequências de miRNAs de famílias conservadas em outras espécies e já descritas anteriormente. Em seguida, a identificação de potenciais novos miRNAs obedeceu a uma sequência de critérios já descritos. As sequências de pequenos RNAs foram mapeadas fisicamente no genoma identificando assim os potenciais locos dos genes MIR e permitindo a validação in silico pela análise da estrutura secundária compatível com os parâmetros de precursores, satisfazendo a primeira premissa para a validação de um novo miRNA. Os números totais obtidos mostram claramente a cautela que deve existir na análise de dados de sequenciamento de pequenos RNAs. Dentre os grandes números obtidos, parte é Há pouco mais de uma década foi descrita a função de mais uma classe de elementos regulatórios chamados de micro RNAs – miRNAs. Inicialmente descritos como reguladores pós transcricionais envolvidos no processo desenvolvimento, estes já tiveram papel validado em uma ampla gama de processos como germinação, determinação de morfologia e respostas a estresse biótico e abiótico. A descrição desta classe de reguladores em Eucalyptus contribui com o conhecimento científico deste importante e vasto gênero inserindo mais um relevante elemento na anotação do recente genoma de referência de Eucalyptus grandis. Para a identificação em escala genômica de miRNAs em Eucalyptus, foi realizado um sequenciamento de pequenos RNAs em larga escala em amostras de folha e xilema em desenvolvimento nas duas principais espécies plantadas do gênero – E. grandis e E. globulus. Com o objetivo de otimizar o processo de descoberta de locos de pequenos RNAs, as amostras de folha e xilema de E. grandis usadas no sequenciamento foram da mesma árvore BRASUZ1, usada no sequenciamento do genoma de referência de Eucalyptus. O sequenciamento permitiu, além da descoberta de pequenos RNAs, uma análise da variabilidade interespecífica pelo mapeamento das sequências de ambas as espécies contra o genoma de E. grandis. A caracterização in silico das sequências obtidas com o sequenciamento obedeceu a uma sequência de passos iniciada pela busca, por similaridade de sequência, visando a identificação de sequências de miRNAs de famílias conservadas em outras espécies e já descritas anteriormente. Em seguida, a identificação de potenciais novos miRNAs obedeceu a uma sequência de critérios já descritos. As sequências de pequenos RNAs foram mapeadas fisicamente no genoma identificando assim os potenciais locos dos genes MIR e permitindo a validação in silico pela análise da estrutura secundária compatível com os parâmetros de precursores, satisfazendo a primeira premissa para a validação de um novo miRNA. Os números totais obtidos mostram claramente a cautela que deve existir na análise de dados de sequenciamento de pequenos RNAs. Dentre os grandes números obtidos, parte é representada por contaminantes como RNA ribossômico e de cloroplasto. Dentre os pequenos RNAs regulatórios, diferentes classes e subclasses estão representadas e os critérios para declarar uma sequência de pequeno RNA como um miRNA devem ser cuidadosamente observados. A validação experimental das sequências de potenciais novos miRNAs foi, inicialmente, realizada via northern blot de algumas das sequências mais expressas em cada uma das amostras sequenciadas. Uma validação em larga escala foi realizada utilizando um microarranjo contendo milhares das sequências putativas de miRNAs descobertas no sequenciamento. Além da análise interespecífica, foram utilizadas amostras de tecidos distintos – folha, xilema, ovário e plântulas – visando uma análise da variabilidade de expressão entre tecidos. A predição de alvos para os candidatos a novos miRNAs foi realizada in silico buscando por sequências que apresentem complementariedade às sequências dos miRNAs utilizando o banco de transcritos de Eucalyptus disponível publicamente no site que hospeda os genomas sequenciados pelo JGI (phytozome.net). A análise dos dados de sequenciamento em larga escala revelou aspectos interessantes do repertório de pequenos RNAs. Sequências de 21 nucleotídeos altamente expressas nas amostras sequenciadas foram caracterizadas como pequenos RNAs interferentes (siRNAs) secundários, ou trans-acting siRNAs (tasi-RNAs), sintetizados em fase a partir da clivagem de transcritos alvo por miRNAs. A identificação de alvos desses tasiRNAs revelou um mecanismo conservado de regulação da expressão de genes envolvidos na defesa contra patógenos, notadamente, os da família caracterizada pelos domínios protéicos NBS-LRR (NB-ARC – leucine rich repeat), e de genes da família PPR (pentatricopeptide repeat). ______________________________________________________________________________ ABSTRACTA decade ago function of another class of regulatory elements called micro RNAs – miRNAs – was elucidated. Initially described as post-transcriptional regulators involved in development, these elements had been proved to regulate a wide range of processes such as germination, morphology and responses to biotic and abiotic stress. The description of miRNAs in Eucalyptus contributes to scientific knowledge of this important and vast genre inserting another important element in the annotation of Eucalyptus grandis reference genome. For genome wide identification of Eucalyptus miRNAs, large scale sequencing was performed in leaves and developing xylem in the two most planted species for cellulose production - E. grandis and E. globulus. In order to optimize the discovery process of small RNAs loci, samples of E. grandis leaf and xylem used were from the same tree BRASUZ1, used for the reference genome. Interspecific analysis was conducted based on mapping of the sequences from both species against the genome of E. grandis. In silico characterization started by searching for sequence similarity against miRBase conserved miRNAs. The identification of potential new miRNA sequence followed the criteria already described. Sequences of small RNAs derived from large-scale sequencing were mapped against the genome thereby identifying potential MIR loci and enabling validation by in silico analysis of secondary structure compatible with miRNA precursor parameters satisfying the first premise for the validation of a new miRNA. Total number of sequences otained clearly shows that caution must exist in small RNA sequencing data analysis. Great part of sequences is represented by contaminants such as ribosomal and chloroplast RNA. Among the small regulatory RNAs, different classes and subclasses are represented and the criteria for declaring a sequence of small RNA as a miRNA should be carefully observed. Experimental validation of potentially new miRNA sequences was first performed via northern blot of some of the more expressed sequences in each of the samples. A large- scale validation was then performed using a microarray containing thousands of sequences of putative miRNAs discovered in sequencing. Besides interspecific analysis, samples from different tissues - leaf, xylem, ovary and seedlings – were used to evaluate tissue variability. Target prediction for putative new miRNAs was performed in silico. A search for complementary sequences to the miRNAs was performed using Eucalyptus transcript database publicly available on the website that hosts the genomes sequenced at JGI (phytozome.net). Data analysis from large scale sequencing revealed interesting aspects of small RNAs repertoire. Highly expressed 21 nucleotide sequences were characterized as small interfering RNAs (siRNAs), or trans-acting siRNAs (tasi-RNAs), synthesized in phase from cleavage of transcripts targeted by miRNAs. Identification of targets for these tasiRNAs revealed a conserved mechanism regulating the expression of genes involved in defense against pathogens, especially those from the family characterized by NBS-LRR protein domains (NB-ARC - leucine rich repeat) and PPR gene family (pentatricopeptide repeat)