Effect of insulin on the competence of bovine oocytes in defined medium

A adição de soro nos meios de maturação in vitro (MIV) de complexos cumulus-oócito (CCOs) é pratica comum em laboratórios de pesquisa e comercias. A adição de fatores de crescimento ou hormônios nos meios de MIV tem sido uma alternativa ao uso de soro além de proporcionar um maior conhecimento das necessidades dos gametas em condições in vitro. A insulina é um hormônio anabólico e possui efeitos sinérgicos ao FSH melhorando o Crosstalk células do cumulus-oócito. Objetivou-se neste trabalho avaliar a adição de insulina em doses crescentes em meio Alpha MEM livre de soro contendo FSH, utilizando como parâmetros de avaliação a taxa de maturação nuclear, a quantificação de transcritos associados ao metabolismo, competência oocitária e estresse celular além do desenvolvimento embrionário. Os CCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente entre os cinco tratamentos de MIV: T1 (controle): TCM199 + 10% SFB (TCM); T2: Alpha-MEMB (A-MEM i0); T3: Alpha-MEMB + 1ng/mL insulina (A-MEM i1); T4: Alpha-MEMB + 10ng/mL insulina (A-MEM i10); T5: Alpha-MEMB + 100ng/mL insulina (A-MEM i100). Não houve diferença entre os tratamentos para oócitos encontrados no estágio intermediário (metáfase I à telófase I) ao término da MIV. Porém, o tratamento controle apresentou menor percentual de oócitos imaturos que os demais tratamentos, assim como maior taxa de oócitos em Metáfase II (MII) que os tratamentos A-MEM i0, A-MEM i1, A-MEM i10. O tratamento A-MEM i100 apresentou percentual de oócitos em MII semelhante ao tratamento controle. O RNAm total foi extraído de três pools de oócitos maturados nos tratamentos em meio Alpha MEM (4 tratamentos) e usados para gerar cDNA. A abundância relativa dos transcritos GDF9, GLUT1, PRDX1 e HSP70.1 foi analisada por Real Time-PCR utilizando A-MEMi0 com calibrador. Maior quantidade de transcrito GDF9 foi encontrada em meio A-MEMi0 que os demais tratamentos. Não houve diferença na quantidade relativa do transcrito GLUT1 entre os tratamentos. O transcrito PRDX1 foi menos expresso em A-MEMi10 e A-MEMi100 do que A-MEMi0. HSP70.1 foi menos expresso em oócitos maturados em meio A-MEMi1, A-MEMi10 e A-MEMi100. Na etapa de FIV, CCOs dos 5 tratamentos foram maturados, fertilizados e os possíveis zigotos cultivados in vitro por oito dias. As taxas de clivagem foram obtidas 48h após inicio do cultivo e as taxas de blastocistos oito dias após fecundação. As taxas de clivagem foram semelhantes entre todos os tratamentos. Apenas o meio A- MEMi100 apresentou maior taxa de produção de blastocistos comparado ao meio A-MEMi0. Todas as demais comparações não apresentaram diferença entre si. Em conclusão, a adição de 100ng/mL de insulina em meio Alpha MEM aumenta a produção de embriões. Além disso, a insulina é capaz de diminuir a expressão de transcritos associados ao estresse celular causado em condições de cultivo in vitro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe addition of serum on in vitro maturation medium (IVM) of cumulus-oocytes complexes (COCs) is common practice in research and commercial laboratories. The addition of growth factors or hormones in IVM media has been an alternative to the use of serum to providing a better understanding of the needs of the gametes on in vitro conditions. Insulin is an anabolic hormone with FSH synergistic effects to improve the crosstalk oocyte-cumulus cells. The objective of this study was to evaluate the addition of insulin in increasing doses in Alpha MEM medium serum free plus FSH, using as evaluation parameters to nuclear maturation rate, quantification of transcripts associated with metabolism, cellular stress and oocyte competence and production of embryos. The COCs were randomly distributed among the five IVM treatments: T1 (control): TCM199 + 10% FCS (TCM), T2: Alpha-MEMB (A-MEM i0), T3: Alpha-MEMB + 1ng/mL insulin ( A-MEMi1), T4: Alpha-MEMB + 10ng/mL insulin (A-MEM i10), T5: Alpha-MEMB + 100ng/ml insulin (A-MEM i100). There was no difference between treatments for oocytes found in the intermediate stage (metaphase I to telophase I) at the end of IVM. However, the control treatment showed the lowest percentage of immature oocytes than the other treatments, as well as higher rate of oocytes in metaphase II (MII) that treatments A-MEM i0, A-MEM i1, A-MEMi10. The A-MEM i100 percentage of MII oocytes was similar to control. Total mRNA was extracted from three pools of oocytes matured in Alpha MEM medium treatments (4 treatments) and used to generate cDNA. The relative abundance of transcripts GDF9, GLUT1, PRDX1 and HSP70.1 was analyzed by Real-Time PCR using A-MEMi0 as calibrator. Greater amount of GDF9 transcript was found in the A-MEMi0 than the other treatments. There was no difference in the relative amount of the transcript GLUT1 between treatments. The PRDX1 transcript was downregulated in A-MEMi10 and A-MEMi100. HSP70.1 was downregulated in oocytes matured in A-MEMi1, A-MEMi10 and MEMi100. In step IVF, COCs were matured of the five treatments. Cleavage rates were obtained 48 hours after the beginning of cultivation and blastocyst rates eight days after fertilization. Cleavage rates were similar among all treatments. The A-MEMi100 showed the highest blastocyst production compared to A-MEMi0. All other comparisons showed no difference. In conclusion, the addition of 100ng/ml insulin in MEM Alpha medium increases the production of embryos, however smaller doses tested did not promote increased. Moreover insulin is able to decrease the expression of transcripts related to cellular stress caused by in vitro culture conditions