Análise funcional de proteínas efetoras de Meloidogyne incognita com potencial aplicação no controle de fitonematoides

Nematoides formadores de galhas (NFG) (Meloidogyne spp.) são endoparasitas biotróficos que possuem uma ampla gama de hospedeiros. O sucesso do parasitismo dos NFG depende da indução e manutenção de sítios de alimentação altamente especializados que são compostos por células gigantes. Os NFG produzem uma série de proteínas nas glândulas secretoras e as injetam, via estilete, nas células da planta hospedeira para manipular o seu metabolismo. Elucidar o papel das proteínas secretadas é essencial para o entendimento das bases moleculares do processo de parasitismo dos nematoides, bem como para o desenvolvimento de novas estratégias para o controle destes parasitas. Este trabalho é o início de uma análise detalhada sobre o papel que três proteínas efetoras de M. incognita, MSP2, MSP7 e MSP18, desempenham na interação com arroz (Oryza sativa). Os genes de parasitismo de M. incognita MSP2, MSP7 e MSP18 codificam para proteínas de 210, 176 e 172 aminoácidos, respectivamente, são expressos nas glândulas secretoras do nematoide e possuem peptídeo sinal de secreção na extremidade N-terminal. A análise de expressão através de qRT-PCR mostrou que estes genes apresentam diferentes padrões de expressão durante interação planta-nematoide, sendo que MSP2 tem seu pico de expressão na fase inicial de estabelecimento do parasitismo, enquanto MSP7 e MSP18 são expressos ao longo de todo o ciclo de parasitismo. Resultados de experimentos de transformação transiente de células da epiderme de cebola, via biobalística, mostraram que o produto da fusão MSP2-EGFP apresentou forte sinal de fluorescência no núcleo, enquanto que os produtos das fusões MSP7-EGFP e MSP18-EGFP mostraram sinal de fluorescência no citoplasma e no núcleo da célula vegetal. Estes resultados mostram que estas proteínas são direcionadas a diferentes compartimentos subcelulares da célula vegetal. Foram obtidas plantas transgênicas de arroz (O. sativa cv. Nipponbare) expressando as proteínas MSP2, MSP7 e MSP18, sem o peptídeo sinal de secreção, e micro-RNAs artificiais (amiRNAs) capazes de silenciar a expressão dos genes corespondentes no nematoide. Para cada gene estudado, dois amiRNAS foram selecionados. Para cada construção uma média de 24 plantas transgênicas foram obtidas. Análises de Southern-blot and qPCR foram realizadas para identificar plantas T0 com apenas uma cópia do transgene e para cada construção foram selecionadas três linhagens T1 para avanço de geração e, posterior, realização de bioensaios. A análise do processo de infecção das plantas transgênicas por M. incognita irá permitir a identificação de genes essenciais para o estabelecimento do parasitismo. Os dados obtidos nestas análises irão ampliar o conhecimento sobre as proteínas efetoras de fitonematoides e trazer novas possibilidades para o desenvolvimento de estratégias de controle de Meloidogyne spp. em arroz e outras culturas de interesse. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTRoot-knot nematodes (RKN) (Meloidogyne spp.) are endo-parasites with a wide host range. Effector proteins, produced in the nematode esophageal gland cells and released in the host plant cells through stylet, dramatically modify selected plant cells into giant-cells, which are the permanent food source to the sedentary nematode. Elucidating the role of different nematode effectors is essential to understanding the molecular basis of nematode parasitism as well as to developing new nematode control strategies. This study is the beginning of an extensive analysis to assess the functional role of three M. incognita effector proteins, MSP2, MSP7 and MSP18, during rice-nematode interaction. The coding sequence of MSP2, MSP7 and MSP18 encoded proteins with 210, 176 e 172 amino acids, respectively, including N-terminal signal peptides. These genes are expressed exclusively in the nematode esophageal gland cells. qPCR analysis of transcript accumulation showed that MSP2, MSP7 and MSP18 genes displayed different expression patterns during host infection. MSP2 reaches the maximum expression level in the beginning of parasitism cycle. MSP7 and MSP18 are highly expressed during the whole parasitism cycle. To test the localization of MSP2, MSP7 and MSP18 in plant cells, a protein transient expression assay was performed. The fusion product of MSP2-GFP showed a strong fluorescence signal in plant nuclei, while the fluorescence signal of the MSP7-GFP and MSP18-GFP fusion products were observed in plant cytoplasm and nuclei. Reverse and forward genetic analyses were conducted to assess the role of the candidate proteins in plant-nematode interactions. We used rice (Oryza sativa cv. Nipponbare) to generate transgenic plants expressing MSP2, MSP7 and MSP18 full-length cDNAs or artificial micro-RNAs (amiRNAs) able to silence the cognate genes in the nematode. For each gene studied, two amiRNAs were selected to perfectly match the M. incognita candidate gene but not other nematode or plant sequences. For each construct, an average of 24 plants was recovered. Southern- blots and qPCR analyses identified single-copy gene (or amiRNA) constructs insertion in the genome of the transformed plants (T0 plants). Assessment of nematode growth and development on transgenic plants will allow selecting genes involved in establishing the compatibility with the host plant. Data obtained should significantly widen our knowledge of molecular players contributing to nematode pathogenicity, opening new avenues for Meloidogyne spp. control strategies in rice and other crops of interest which are highly susceptible to M. incognita