Comparação entre o congelamento lento e a vitrificação na criopreservação de tecido ovariano de suínos

Os avanços nas tecnologias reprodutivas têm aumentado o aproveitamento do material genético de animais de interesse zootécnico ou ameaçados de extinção. A criopreservação de ovócitos imaturos inclusos no tecido ovariano é uma alternativa para a preservação de diversas espécies, particularmente em suínos, visto que ovócitos maduros desse grupo são extremamente sensíveis a baixas temperaturas. A escolha da técnica de criopreservação (congelamento lento ou vitrificação) interfere na eficiência de preservação do material, por isso, são necessários estudos que visem o desenvolvimento de protocolos de conservação das células germinativas inclusas em folículos pré-antrais (FPA) suínos. O objetivo deste trabalho foi comparar o efeito de técnicas de criopreservação, congelamento lento e vitrificação, na morfologia de FPA inclusos no tecido ovariano de suínos. Os fragmentos do tecido ovariano foram submetidos a dois protocolos de vitrificação (V1 e V2) e um de congelamento lento (CL), vitrificados em superfície sólida ou congelados em um freezer programável. Na V1, os fragmentos foram imersos em uma solução de equilíbrio (SE) de DMSO 1,0 M e uma solução de vitrificação (SV) de DMSO 2,0 M + acetamida 1,0 M + propanodiol 3,0 M. Para a V2, utilizou-se SE contendo etilenoglicol 0,6 M e SV contendo etilenoglicol 5,6 M + polivinilpirrolidona 0,45 M e 13,7% sacarose. Para o CL, os fragmentos foram colocados em criotubos com solução de etilenoglicol 1,5 M e 0,4% sacarose. As amostras foram congeladas pelo método lento ou vitrificadas em superfície sólida e todos os fragmentos foram armazenados em nitrogênio líquido. Após o reaquecimento ou descongelamento, as amostras foram fixadas e processadas para microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os dados das porcentagens de folículos morfologicamente normais (FMN) foram submetidos ao teste de Tukey. As médias de FMN foram 97,1±2,6 para o controle, 96,1± 3,0 para a V1, 81,1±14,8 para a V2 e 86,7±7,3 para o CL. As porcentagens de FMN no CL e na V2 foram estatisticamente menores (P<0,05) que a do controle e a da V1, a qual por sua vez foi estatisticamente igual ao controle. Para a análise ultraestrutural, foram avaliados apenas FPA caracterizados como morfologicamente normais nos cortes semi-finos, e somente dos melhores tratamentos. A ultraestrutura celular de FPA criopreservados pelo método V1 apresentou vários sinais de degeneração, enquanto FPA congelados pela técnica CL apresentaram morfologia normal, semelhante ao controle. Em conclusão, a técnica de CL foi mais eficiente para preservar folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano de suínos, entretanto o aperfeiçoamento da técnica de vitrificação para tecido ovariano suíno ainda é necessário. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTAdvances in reproductive technologies have increased the use of genetic material from animals of zootechnical interest or endangered species. Cryopreservation of oocytes enclosed in ovarian tissue is an alternative for preservation of many species, particularly pigs, since mature oocytes of this group are extremely sensitive to low temperatures. The choice of technique for cryopreservation (slow freezing or vitrification) interferes with the efficiency of preservation of the material, thus, studies are needed for the development of protocols for conservation of germ cells enclosed in preantral follicles (PAF) of pigs. The aim of our study was to compare the effect of cryopreservation techniques, slow freezing and vitrification, on morphology of PAF included in the ovarian tissue of pigs. The fragments of ovarian tissue were submitted to two vitrification protocols (V1 and V2) and one slow freezing (SF) protocol, vitrified on solid surface or frozen in a programmable freezer. In V1, fragments were immersed in an equilibrium solution (ES) of DMSO 1.0 M and a vitrification solution (VS) of DMSO 2.0 M + acetamide 1.0 M + propanediol 3.0 M. For V2, ES contained 0.6 M and VS contained ethylene glycol 5.6 M + polyvinylpyrrolidone 0.45 M and 13.7% sucrose. For the SF, fragments were placed in cryotubes with solution of 1.5 M ethylene glycol and 0.4% sucrose. Samples were slow cooled or vitrified by solid surface vitrification and all fragments were stored in liquid nitrogen. After reheating or defrosting, samples were fixed and processed for light microscopy and transmission electron microscopy. Data for the percentage of morphologically normal follicles (MNF) were subjected to Tukey's test. Mean MNF were 97.1±2.6 for control, 96.1±3.0 for V1, 81,1± 14,8 for V2 and 86,7± 7,3 for SF. The percentages of MNF in SF and in V2 were lower (P