Produção e caracterização de alotetraploides sintéticos entre espécies silvestres do gênero Arachis

Registros arqueológicos indicam que o amendoim foi domesticado por índios há pelo menos 3.500 anos na América do Sul. O amendoim (Arachis hypogaea L.) pertence à família Fabaceae, subfamília Faboidea. O gênero Arachis é composto por cerca de 80 espécies, todas endêmicas da América do Sul. O Brasil se destaca por reunir todas as secções e a maioria das espécies. As espécies silvestres, mais próximas ao amendoim cultivado são quase todas diploides e são classificadas em genomas A, B e D. O grupo de genoma B (B lato sensu) foi recentemente dividido em três subgrupos: B sensu stricto, F e K. O amendoim cultivado é um tetraploide, com dois componentes genômicos distintos, cada um com 10 pares de cromossomos, A e B. As espécies com genomas A e B lato sensu são de maior interesse na busca de genes úteis para introgressão, por possuírem genomas semelhantes aos do amendoim cultivado. A utilização de espécies selvagens como fonte de resistência a pragas e doenças tem mostrado ser uma promessa para muitas culturas. Neste trabalho, um número de espécies silvestres diploides com genomas A, B sensu stricto, K, alotetraploides e cultivares de amendoim foram testados quanto à resistência contra a ferrugem (Puccinia arachidis), uma das mais importantes doenças fúngicas do amendoim. Os bioensaios foram feitos usando a técnica da folha destacada. Com exceção das cultivares controles e de uma das espécies silvestres (A. ipaënsis), todos os outros genótipos avaliados mostraram-se resistentes. Os acessos A. gregoryi V6389, A. duranensis SeSn2848, A. stenosperma V10309, A. duranensis V14167, A. villosa V12812, foram os mais resistentes. Híbridos foram produzidos a fim de introgredir genes de resistência a doenças, das espécies silvestres para o amendoim cultivado. No entanto, a hibridação direta entre amendoim cultivado, que é um tetraploide, e as espécies silvestres diploides produz híbridos triploides estéreis. Para superar essa barreira de infertilidade, um esquema de hibridação conhecido como "a rota tetraploide" foi usado. Híbridos interespecíficos foram obtidos entre espécies de genomas A e B lato sensu. Foram feitos cruzamentos entre as espécies, utilizando combinações B x A. No total, 90 híbridos estéreis AB foram obtidos, e foi confirmada a hibridação pela utilização de marcadores moleculares. Estes híbridos AB eram estéreis. Estacas destes híbridos foram tratadas com colchicina para induzir duplicação cromossômica e recuperar a fertilidade. O objetivo foi produzir um genoma tetraploide fértil que é sexualmente compatível com o amendoim cultivado. A restauração da fertilidade foi confirmada com o surgimento de uma estrutura, ginóforo (uma extensão do ovário fecundado), após a floração. No total, 75 plantas resultantes dos cruzamentos A. ipaënsis KG30076 x A. villosa V12812, A. batizocoi K9484 x A. stenosperma V10309, A. batizocoi K9484 x A. duranensis SeSn2848, A. batizocoi K9484 x A. duranensis V14167e A. gregoryi V6389 x A. stenosperma V10309, recuperaram a fertilidade e produziram 2259 sementes viáveis. A fim de confirmar que os híbridos tinham o número esperado de cromossomos, análise citogenética foi feita. Para a detecção de bandas cromossômicas heterocromáticas foi utilizado DAPI, que apresenta afinidade para os nucleotídeos adenosina e timina. O número tetraploide esperado com 40 cromossomos foi confirmado em uma quantidade representativa das combinações híbridas. Híbridos alotetraploides foram cruzados com cultivares das duas subespécies de A. hypogaea: A. hypogaea subsp. hypogaea (Runner e Caiapó) e A. hypogaea subsp. fastigiata (BR1, Senegal e Havana). A fertilidade e a produção de sementes, a produção de ginóforos em relação ao número de flores polinizadas, o tempo decorrido entre a emergência do ginóforo e sua frutificação, e a produção total de ginóforos foram registrados, permitindo que as características de cruzabilidade dos genótipos fossem inferidas. Todas as combinações do cruzamento [amendoim cultivado x alotetraploides] produziram sementes F1 viáveis, embora com fertilidades diferentes. A caracterização citogenética do híbrido resultante do cruzamento de A. hypogaea com o alotetraploides [A. batizocoi K9484 x A. stenosperma V10309]4x foi também realizada. Observações com DAPI e GISH confirmaram a presença de 40 cromossomos. Os cromossomos mostraram a hibridação esperada e padrões de bandas característicos do genoma B (banda heterocromática ausente) e dos genomas A e K (bandas heterocromáticas positivas de DAPI na região do centrômero), representando o cariótipo 2n=4x (2A + 1B + 1K). Os resultados obtidos são promissores e indicam o potencial de novas combinações alélicas das espécies silvestres a serem introgredidas nas cultivares de A. hypogaea. _______________________________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACTArcheological registers indicate that the peanut was first domesticated by South American Indians about 3.500 years ago. The peanut (Arachis hypogaea L.) belongs to the family Fabaceae, subfamily Faboidea. The genus Arachis is composed by nearly 80 species, all endemic from South America. Brazil gathers all the sections and most of the species. The wild species, which are closer to the cultivated peanut, are classified in the A, B and D genomes and are almost all diploids. The group which contains the B genome (B lato sensu) was recently divided in three subgroups: B sensu stricto, F e K. The cultivated peanut is a tetraploid, with two different genomic components, each one with 10 pairs of chromosomes, A and B. The species with genomes A and B lato sensu are the ones of a greater interest in the search of useful genes for the introgression because their genomes are similar to the cultivated peanut ones. The use of wild species as a source of resistance to pests and diseases has been affirmed as a promise for many cultures. In this work, a number of diploid wild species with genomes A, B sensu stricto, K, alotetraploids and varieties of peanut were tested to the resistance to the rust (Puccinia arachidis), one of the most important diseases in the peanut. The biotests were made using the detached leaf technique. Excluding the control varieties and one of the wild species (A. ipaënsis), all the other analyzed genotypes were resistant. The accesses A. gregoryi V6389, A. duranensis SeSn2848, A. stenosperma V10309, A. duranensis V14167, A. villosa V12812, were the most resistant. Hybrids were produced to insert resistance to disease genes from the wild species to the cultivated peanut. However, the direct hybridization between cultivated peanut – a tetraploid – and the wild diploid species produce hybrids sterile triploids. To overcome this infertility barrier, a hibridization plan – known as ―tetraploid route" – was used. Interspecific hybrids were obtained between species of genomes A and B lato sensu. Crossings were made between the species, using combinations B x A. In total, 90 sterile hybrids AB were obtained, and it was confirmed the hybridization by use of molecular markers. These hybrids AB were sterile. Poles of these hybrids were treated with colchicine to induce chromosomal duplication and regain the fertility. The objective was to produce a tetraploid fertile genome sexually compatible to the cultivated peanut. The restoration of fertility was confirmed with the appearance of a structure – gynophore (an extension of the impregnated ovary) – after blooming. In total, 75 plants, originated from the crossings A. ipaënsis KG30076 x A. villosa V12812, A. batizocoi K9484 x A. stenosperma V10309, A. batizocoi K9484 x A. duranensis SeSn2848, A. batizocoi K9484 x A. duranensis V14167e A. gregoryi V6389 x A. stenosperma V10309, recovered the fertility and produced 2259 viable seeds. In order to confirm that the hybrids had the expected number of chromosomes, a cytogenetic analysis was made. To detect the heterochromatic chromosomic bands, DAPI was used, which indicates the affinity for the nucleotides adenosine and timine. The expected number tetraploid with 40 chromosomes was confirmed in a representative number of the hybrid combinations. Alotetraploid hybrids were crossed with varieties of the two subspecies of A. hypogaea: A. hypogaea subsp. hypogaea (Runner e Caiapó) and A. hypogaea subsp. fastigiata (BR1, Senegal e Havana). The fertility and the production of seeds, the production of gynophores in relation to the number of pollinated flowers, the elapsed time between the gynophore emergency and its fructification and the total production of gynophores were registered, allowing the deduction of the crossing characteristics of the genotypes. All the combinations of the crossing [cultivated peanut x alotetraploids] produced viable F1 seeds, although with different fertilities. The cytogenetic characterization of the hybrid resultant to the crossing of A. hypogaea with the alotetraploids [A. batizocoi K9484 x A. stenosperma V10309]4x was also made. Observations with DAPI and GISH confirmed the presence of 40 chromosomes. The chromosomes showed the expected hybridization and patterns of bands characteristics from genome B (absent heterochromatic band) and from the genomes A and K (heterochromatic positive bands of DAPI in the centromere region), representing the karyotype 2n=4x (2A + 1B + 1K). The results obtained are promising and indicate the potential of new allelic combinations of wild species to be introduced in varieties of A. hypogaea