Caracterização do secretoma de Aspergillus niger crescido em bagaço de cana e purificação de xilanases de interesse biotecnológico

Os fungos filamentosos quando submetidos ao crescimento em meios contendo material lignocelulósico, são capazes de produzir diferentes tipos de enzimas extracelulares responsáveis por catalisar a hidrólise de celulose, hemicelulose e outros polissacarídeos encontrados nas paredes celulares vegetais. Algumas dessas enzimas podem ser aplicadas comercialmente em processos industriais, como nas indústrias alimentícia, têxtil, papeleira e também na produção de bioetanol. O fungo filamentoso mesofílico e de distribuição cosmopolita Aspergillus niger é saprófita e apresenta potencial biotecnológico como produtor de enzimas hidrolíticas O presente trabalho tem como objetivo a purificação de xilanases de A. niger bem como a análise do seu secretoma (conjunto de proteínas secretadas) após seis dias de crescimento em meio sintético suplementado com 1% de bagaço de cana como única fonte de carbono. Uma fração xilanolítica (Xyl) previamente purificada por cromatografia de exclusão molecular revelou ser composta por polipeptídeos distintos apresentando diferentes pIs como demonstrado por eletroforese bidimensional (2-DE). A fim de aperfeiçoar a purificação de Xyl e separar possíveis isoformas, Xyl foi submetido às cromatografias de troca aniônica (CTA) em pH 8,5 e de troca catiônica (CTC) em pH 5,0. A CTA separou uma fração contendo apenas dois polipeptídeos como demonstrado por 2-DE. Um spot foi identificado como sendo uma endo-1,4-β-xilanase e o outro não pôde ser identificado. A xilanase presente na fração purificada exibiu um Km de 6.46 mg/ml e uma Vmax de 1.984 UI.mL-1 para xilana solúvel. A fim de ser submetido à análise proteômica,o secretoma foi primeiramente submetido à digestão tríptica tanto em solução quanto após separação eletroforética em gel de poliacrilamida. Os peptídeos resultantes foram analisados por LC-MS/MS-Orbitrap em modo Data Dependent Acquisition. A abordagem de digestão em gel propiciou a identificação de 55 proteínas comparada à identificação de apenas 14 proteínas utilizando a digestão em solução. A maioria das proteínas identificadas pertence à classe das hidrolases, sendo as xilanases as mais abundantes. Estes resultados correspondem aos ensaios enzimáticos realizados e à composição esperada do secretoma: um arsenal de enzimas capazes de promover a hidrólise do substrato e prover meios para o desenvolvimento e crescimento do fungo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTWhen submitted to growth in media containing lignocellulosic materials, filamentous fungi are able to produce different kinds of extracellular enzymes, which are responsible to catalyze the hydrolysis of cellulose, hemicellulose and other polysaccharides found on plant cell wall. Some of these enzymes can be commercially applied to industrial processes, such as the ones used on food, paper and textile industry as well as on the production of bioethanol. Aspergillus niger, a mesophilic and saprophytic filamentous fungus, possesses biotechnological potential as a producer of hydrolytic enzymes. The present work aims at purifying xylanases from A. niger and analyzing its secretome (group of secreted proteins) after six days of growth on synthetic medium supplemented with 1% sugarcane bagasse as the only carbon source. A xylanolytic fraction (Xyl) previously purified by molecular exclusion chromatography was shown to be composed of different polypeptides bearing different pIs as demonstrated by two-dimensional electrophoresis (2-DE). In order to improve Xyl purification and to separate possible xylanase isoforms, Xyl was submitted to both Anion Exchange Chromatography (AEC) at pH 8.5 and Cation Exchange chromatography (CEC) at pH 5.0. The AEC approach could successfully isolate a fraction containing two different polypeptides as demonstrated by 2-DE. One spot was identified as an endo-1,4-β-xylanase and the other couldn’t be identified. This xylanase in the purified fraction exhibited a Km of 6.46 mg/ml and a Vmax of 1.984 IU.mL-1 for soluble xylan. For proteomic analysis, the secretome was firstly submitted to In-solution trypsin digestion or alternatively to SDS-PAGE followed by trypsin digestion of gel slices. Resulting peptides were then analyzed by LC-MS/MS-Orbitrap using Data Dependent Acquisition mode. Overall, the In-gel digested samples provided identification of 55 proteins comparing to only 14 identified proteins in In-solution digested samples. Most proteins identified in A. niger secretome belonged to the hydrolase class, being xylanases the most abundant ones. These findings correspond to experimental enzymatic assays and the expected secretome composition: an arsenal of enzymes capable of hydrolyzing the substrate and providing ways for the fungi growth and development