Detecção molecular de Xanthomonas campestris pv. viticola em videiras assintomáticas

O cancro bacteriano da videira, causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) Nayudu ( (Dye), foi detectado no Brasil pela primeira vez em 1998, em plantas de Vitis vinifera, variedade Red Globe, em Petrolina, Pernambuco. A doença é responsável por prejuízos ao cultivo da videira no Vale do Submédio São Francisco, apresentando incidência expressiva e importância econômica. Uma das medidas mais eficazes para conter sua disseminação para novas áreas é o uso de material de propagação livre do patógeno. Este estudo teve como objetivo geral otimizar a técnica de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) para detecção de Xcv em tecidos assintomáticos de videira. Foram objetivos específicos: determinar o limite mínimo de detecção por BIO-PCR aliado ao uso de meio semi-seletivo NYDAM e por Nested-PCR em frutos e folhas inoculados e assintomáticas; desenvolver um controle interno para falsos negativos e validar a BIO-PCR e a Nested-PCR em mudas de viveiros e em plantas sintomáticas e assintomáticas de áreas de produção no Vale do Submédio São Francisco. A determinação do limite mínimo de detecção de Xcv por BIO-PCR e Nested-PCR foi realizada com a inoculação de Xcv em frutos e folhas de videira nas concentrações de 102 a 108 ufc/ml. O limite mínimo de detecção por BIO-PCR em frutos e folhas foi de 102 ufc/ml. Com a Nested-PCR o limite mínimo de detecção em frutos foi de 102 ufc/ml e de 103 ufc/ml em folhas. Para o desenvolvimento do controle interno, foram incluídos iniciadores universais para o gene do 16S rRNA de bactérias (F984/1492) em reações multiplex com os iniciadores Xcv1F/Xcv3R. Amplificação dos dois fragmentos esperados ocorreu com DNA purificado de Xcv e com amostras positivas (lavados de folhas) por BIO-PCR e Nested-PCR. Contudo, em 16 amostras negativas por Nested-PCR, apenas em uma ocorreu a amplificação do fragmento correspondente ao gene de 16SrRNA. Na validação dos métodos em áreas de produção com histórico da doença, 97% das amostras coletadas com sintomas foram positivas por BIO-PCR e 69,7% positivas por Nested-PCR. Entre as amostras sem sintomas, a detecção de Xcv só foi possível por BIO-PCR (29,7 % das amostras). De 60 amostras de mudas assintomáticas coletadas em dois viveiros na região, detectou-se Xcv por BIO-PCR em três amostras (5%) de um dos viveiros. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTBacterial canker of grapevine, caused by Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) Nayudu (Dye), was detected in Brazil in 1998, affecting plants of Vitis vinifera, cultivar Red Globe, in Petrolina, Pernambuco State. This disease is responsible for economic losses in vineyards in the São Francisco river valley, northeastern Brazil. One of the most effective measures to prevent its dissemination to new areas is the use of pathogen-free propagating material. The objective of the present study was to optimize the PCR (polymerase chain reaction)-based method to detect Xcv in asymptomatic grapevine tissues. The specific objectives were: to determine the minimum detection limits of BIO-PCR combined with the use of the semi-selective medium NYDAM and of Nested-PCR in inoculated and asymptomatic fruits and leaves; to develop an internal control for false negatives; and to validate the BIO-PCR and Nested-PCR methods by testing asymptomatic plants from nurseries and symptomatic and asymptomatic plants from grapevine-producing areas in the São Francisco river valley. The detection limit of BIO-PCR and Nested-PCR was performed by inoculating Xcv in grapevine fruits and leaves, at concentrations from 102 to 108 cfu/ml. The lower detection limit of BIO-PCR in fruits and leaves was 102 cfu/ml. Using Nested-PCR, the detection limit in fruits was 102 cfu/ml, and 103 cfu/ml in leaf samples. To develop the internal control for PCR, universal primers for bacterial 16S rRNA gene (F984/1492) were included in multiplex reactions with primer pair Xcv1F/Xcv3R. Amplification of the two expected fragments occurred with purified Xcv DNA and with samples (washes from leaves) tested positive by BIO-PCR and Nested-PCR. However, only one out of 16 samples tested negative by nested-PCR yielded the 16SrRNA amplicon. When validating the methods in production areas with a history of the disease, 97% of the symptomatic samples were positive by BIO-PCR and 69.7% positive by Nested-PCR. Among asymptomatic samples, detection of Xcv was possible only by BIO- PCR (29.7% of samples). Among 60 samples from asymptomatic plants collected in two nurseries in the region, Xcv was detected by BIO-PCR in three samples (5%) from one of the nurseries