Estudo de fatores associados à virulência e imunidade na interação entre macrófagos e Cryptococcus neoformans

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada patogênica, causadora de meningoencefalite severa. Estima-se uma incidência anual de um milhão de casos de criptococose no mundo, com mais de 600.000 mortes. O desenvolvimento da criptococose se correlaciona fortemente com o estado imunitário do paciente, sendo os macrófagos as principais células efetoras na resposta imune contra esse fungo. O objetivo desta tese é estudar fatores do hospedeiro e do patógeno que sejam importantes durante a interação entre C. neoformans e macrófagos. Os trabalhos desta tese foram divididos em quatro capítulos baseados em quatro objetivos específicos. O primeiro objetivo foi estudar vesículas extracelulares de C. neoformans, utilizadas pelo fungo para secretar polissacarídeos capsulares e outros fatores de virulência. Sondas lipofílicas mostraram vesículas na superfície da cápsula e sugeriram que estas estruturas possuem RNA. Outros dois projetos também mostraram a importância das vesículas na melanização de C. neoformans e na secreção de toxinas por Bacillus anthracis. Outro tema abordado foi o mecanismo de ação de anticorpos monoclonais contra a cápsula de C. neoformans. Experimentos de expressão gênica feitos com fungos expostos a anticorpos monoclonais sugeriram indução da biossíntese de ácidos graxos. Esta alteração metabólica foi confirmada por métodos bioquímicos e se correlacionou com um aumento na susceptibilidade ao antifúngico anfotericina B, sugerindo que anticorpos ajam também alterando o metabolismo do patógeno. Em outro trabalho, foi feita uma varredura com biblioteca de RNAs de interferência para identificar o receptor de superfície do isotipo IgG3 murino. A interferência com um dos genes identificados na varredura, a integrina beta 1 (Itgb1), levou a diminuição da ligação deste isotipo à superfície de macrófagos e da fagocitose mediada por IgG3, sem nenhum efeito na função do isotipo IgG1. Estes resultados sugerem que Itgb1 possa ser o receptor específico deste isotipo de IgG murino, que vem sendo procurado há três décadas. Foram também estudadas por citometria de fluxo a cinética da fagocitose e a exocitose não-lítica de C. neoformans, um fenômeno descrito recentemente pelo qual o fungo é expelido pelo macrófago sem que nenhuma das duas células morra. Drogas que neutralizam a acidez do fagolisossomo alteraram a taxa de exocitose não-lítica, indicando que o pH deste compartimento é importante para a liberação do fungo. Adicionalmente, a metodologia citométrica foi utilizada para medir exocitose não-lítica em pulmões de camundongo, com aproximadamente 45% em comparação com taxa de pouco menos de 10% in vitro. Estes resultados sugerem que a exocitose não-lítica ocorra durante a criptococose, com importantes implicações no entendimento desta doença. Por fim foi testada a hipótese de que a autofagia do macrófago seja importante na resposta imune contra C. neoformans. A autofagia é um mecanismo conservado em eucariotos para a reciclagem de material intracelular que tem sido implicado na imunidade contra um número cada vez maior de patógenos intracelulares. Experimentos de imunofluorescência mostraram fagossomos contendo C. neoformans positivos para o marcador de autofagossomos LC3. RNA de interferência contra ATG5, um gene essencial para autofagia, diminuiu a atividade antifúngica de macrófagos e as taxas de exocitose não-lítica e aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-6, TNF-α, IL-12 e IFN-γ. Camundongos com nocaute condicional de ATG5 não apresentaram nenhuma diferença de sobrevida em relação aos controles após infecção por C. neoformans. Entretanto, estes animais tiveram uma resposta imune com melhor balanço Th1/Th2 que resultaram em menor carga fúngica e diferenças no padrão histopatológico pulmonar. Estes resultados sugerem que a autofagia tem múltiplos papéis na imunidade contra C. neoformans. Em conjunto, estes trabalhos esclarecem alguns pontos na importante relação entre C. neoformans e macrófagos do hospedeiro e podem servir como base para trabalhos translacionais que melhorem a profilaxia ou terapêutica da criptococose. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTCryptococcus neoformans is an encapsulated pathogenic yeast that causes severe meningoencephalitis. It is estimated that over one million cases of cryptococcosis occur each year, with about 600,000 deaths. Macrophages are the main effector cells in immunity against this fungus. The objective of this thesis is to study host and pathogen factors that are important during the interaction between C. neoformans and macrophages. The work described in this thesis has been divided in four chapters based in four specific objectives. The first objective was to study C. neoformans extracellular vesicles, used by the fungus to secrete capsular polysaccharide and several other virulence factors. Lipophilic probes revealed vesicles on the capsule surface and suggested that they may carry RNA. Two other projects also showed the importance of extracellular vesicles in C. neoformans melanization and Bacillus anthracis toxin secretion. Another subject was the mechanism of action of monoclonal antibodies to the C. neoformans capsule. Gene expression studies made with C. neoformans that had been exposed to monoclonal antibodies suggested an induction of fatty acid biosynthesis. This metabolic alteration was confirmed using biochemical methods and correlated with increased susceptibility to the antifungal amphotericin B, suggesting that antibodies also act by altering the metabolism of the pathogen. Another project involved screening an RNAi library to search for the cell surface receptor of murine IgG3. Interference with one of the genes identified in the screening, integrin beta 1 (Itgb1), resulted in decreased binding of this antibody to macrophage surface and impaired IgG3-mediated phagocytosis, with no effect in the function of IgG1. These results suggest that Itgb1 may be the specific murine IgG3 receptor, which has been pursued for over three decades. The kinetics of phagocytosis and non-lytic exocytosis, a recently described phenomenon in which C. neoformans is expelled from macrophages without harm to either cell type, were also studied using flow cytometry. Drugs that neutralize the phagolysosomal acidity altered the non-lytic exocytosis rates, indicating that the pH inside this compartment influences fungal release. Additionally, the cytometric methodology was used to measure non-lytic exocytosis in mouse lungs, with a rate of approximately 45% in comparison with 10% in vitro. The suggestion that non-lytic exocytosis happens during cryptococcosis could have important implications in understanding this disease. Lastly, the hypothesis that macrophage autophagy is involved in the immune response against C. neoformans was tested. Autophagy is a mechanism conserved in all eukaryotes to recycle intracellular material and has been implicated in immunity against an ever-growing list of intracellular pathogens. Immunofluorescence showed C. neoformans-containing phagosomes positive for the autophagosome marker LC3. RNA interference against ATG5, a gene that is essential for autophagy, decreased macrophage antifungal activity and non-lytic exocytosis and increased secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-6, TNF-α, IL-12 e IFN-γ. ATG5 conditional knockout mice had no survival difference compared to controls after infection with C. neoformans. However, these animals had an immune response with better Th1/Th2 balance that resulted in lower fungal burden and different histopathological pattern in the infected lungs. These results suggest that autophagy has multiple roles in immunity against C. neoformans. As a whole, the work described in this thesis clarify some points in the important interaction between C. neoformans and host macrophages and could be the basis for future translational studies that could improve cryptococcosis prophylaxis or therapy