Proteômica de Paracoccidioides brasiliensis : uma análise quantitativa das fases miceliana e leveduriforme e da transição dimórfica

Dimorfismo é uma característica importante para sobrevivência fúngica em diferentes ambientes e tem sido relacionado com a virulência. O fungo ascomiceto, Paracoccidioides brasiliensis, agente causador da paracoccidioidomicose, pode crescer nas fases de micélio ou de levedura. A patogenicidade do P. brasiliensis é frequentemente associada com a transição dimórfica, de saprófita a patogênico, mas os mecanismos que regulam esse processo permanecem obscuros. Uma das maneiras de estudar esse fenômeno seria isolar e caracterizar proteínas que são especificamente expressas em um dos estágios do ciclo de vida e/ou durante a diferenciação. Eletroforese bidimensional (2-DE) foi utilizada para comparar o proteoma de micélio e de levedura do isolado Pb01 e após 22 h de transição de micélio para levedura. Os géis corados pela prata de três replicatas biológicas independentes foram digitalizados e as imagens foram analisadas utilizando-se o software Image Master 2D Platinum 6.0 software (GE Healthcare). A detecção dos spots e o pareamento foram realizados. A intensidade dos spots foi normalizada e as análises estatísticas avaliada por one-way ANOVA. Os spots de interesse obtidos dos géis 2-D foram retirados, digeridos com tripsina e os peptídeos foram então analisados por MS e/ou MS/MS. Um total de 100 proteínas/isoformas foi identificado; 81 foram diferencialmente expressas nas três fases do fungo, enquanto que 19 proteínas/isoformas foram constitutivamente expressas. A expressão de proteínas como superóxido dismutase e peroxiredoxina mitocondrial foi mais abundante na fase miceliana. Nos estágios iniciais da transição (22 h) algumas enzimas envolvidas na glicólise, como enolase e fosfoglicomutase, estão aumentadas. Proteínas de choque térmico e ATP sintase também estão significantemente aumentadas durante o evento de transição. Proteínas preferencialmente expressas na fase leveduriforme foram identificadas. Muitas das enzimas da via glicolítica e algumas enzimas do ciclo do glioxalato e metabolismo de lipídeos foram mais abundantes em levedura. Para validar os resultados dos géis 2-D foi realizado western blotting de seis proteínas diferentes, e os resultados foram confirmados. Os resultados foram validados por RT-PCR em tempo real nas três condições estudadas, incluindo conídio e transição de conídio para levedura. Os resultados demonstram uma mudança no metabolismo durante a transição de micélio para levedura; o mesmo padrão foi evidenciado na transição de conídio para levedura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTFungal dimorphism is important for survival in different environments and has been related to virulence. The ascomycete Paracoccidioides brasiliensis, the causative agent of paracoccidioidomycosis, can grow as mycelia or yeast. The pathogenicity of P. brasiliensis is frequently associated with the dimorphic shift, from a saprobe to a pathogenic lifestyle, but the mechanisms that regulate the process is still poorly understood. One way to study this phenomenon is to isolate and characterize proteins that are specifically expressed in one of the stages of the life cycle and/or during differentiation. Two-dimensional gel electrophoresis we used to investigate the proteins expressed differentially during transition from mycelia to yeast forms of isolate Pb01 after 22 h of temperature shift. Silver-stained gels of three independent biological replicates were digitalized and the images were analyzed using the ImageMaster 2D Platinum 6.0 software (GE Healthcare). Spot detection and matching was performed. Spot intensities were normalized and the statistics analyses were estimated by one-way ANOVA. The spots of interest were excised, in-gel digested with trypsin, and the peptides were then analyzed by MS and/or MS/MS. A total of 100 proteins/isoforms were identified; 81 were differentially expressed in the three phases of the fungus, whereas 19 proteins/isoforms were constitutively expressed. Enzymes such as superoxide dismutase and mitochondrial peroxiredoxin have been detected as abundant in the mycelium phase. After the early stage of transition (22 h) some enzymes involved in glycolysis, such as enolase and phosphoglutomutase, were increased. Heat shock proteins and ATP synthase were also significantly increased in the transition event. Proteins preferentially expressed in the yeast phase were identified. Most of the enzymes of glycolysis, and some of the glyoxylate cycle and lipid metabolism were more abundant in yeast cells. To validate the 2-D gels results we performed western blotting of six different proteins, and the results were confirmed. The results were also validated by real-time RT-PCR in the three studied conditions, including conidia and conidia-yeast transition. The results demonstrated a shift in the metabolism during transition from mycelia to yeast cell; the same patterns were evidenced in the conidia to yeast transition