Purificação e caracterização de peptídeos antimicrobianos isolados das secreções cutâneas de anuros dos gêneros Proceratophrys, Physalaemus e Hypsiboas

As secreções cutâneas dos anfíbios anuros são reconhecidamente uma rica fonte de substâncias bioativas. Um importante grupo dentre esses compostos são os peptídeos antimicrobianos (PAMs). Os PAMs são componentes do sistema imune inato, presentes na maioria dos seres vivos, que vêm despertando um interesse crescente, uma vez que apresentam atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de microrganismos, sendo usualmente atóxicos para células de mamíferos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento, a identificação e a caracterização empregando espectrometria de massa tipo MALDI-TOF de PAMs presentes nas secreções cutâneas dos anuros Proceratophrys goyana, Physalaemus fuscumaculatus e Physalaemus centralis, comumente encontrados na fauna do Cerrado. Também foi objeto do presente a caracterização biológica de duas versões sintéticas do peptídeo ceratoxin-like previamente isolado e quimicamente caracterizado da rã Hypsiboas albopunctatus. As secreções cutâneas das espécies P. goyana, P. fuscumaculatus e P. centralis foram obtidas por estimulação elétrica, liofilizadas e armazenadas a - 20°C. Cada secreção bruta foi submetida a fracionamento por RP-HPLC usando coluna C18 (Shim-pack CLC-ODS, 6.0 x 150 mm) em sistema HPLC com emprego de gradiente linear de TFA 0,1% (v/v) em acetonitrila. A detecção foi monitorada a 216 nm e a eluição realizada com fluxo de 1 mL/min. As frações cromatográficas eluídas foram coletadas manualmente e secadas a vácuo. Diferenças significativas nos perfis cromatográficos de cada espécie foram observadas. Todas as frações cromatográficas obtidas foram avaliadas quanto à capacidade em inibir a proliferação de bactérias patogênicas S. aureus (ATCC 25923) e P. aeruginosa (ATCC 27853), bem como quanto à capacidade de lisar eritrócitos humanos. As frações ativas foram analisadas por espectrometria de massa tipo MALDI-TOF a fim de se avaliar seu grau de pureza e determinar as massas moleculares dos componentes presentes. Peptídeos antimicrobianos foram identificados nas três secreções cutâneas em estudo. As duas versões sintéticas do peptídeo ceratoxin-like contendo Leu ou Ile na porção C-terminal foram avaliados quanto ao seu potencial inibitório sobre o crescimento de sete linhagens de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As duas versões do peptídeo ceratoxin-like de H. albopunctatus apresentaram atividade antibacteriana significativa com MICs que variaram de 2 a 8 μM. Como vários PAMs de amplo espectro de ação também apresentam citotoxicidade para células cancerígenas, tais peptídeos foram testados contra a linhagem celular de câncer cervical (HeLa) e fibroblastos normais (NIH3T3). Os resultados obtidos indicaram que as duas versões testadas exibem atividade citotóxica contras as linhagens celulares avaliadas. Estudos de bioprospecção relacionados com a caracterização química e biológica dos compostos presentes na secreção cutânea de anuros são de extrema relevância, podendo auxiliar no esclarecimento de questões taxonômicas, no desenvolvimento de novas drogas terapêuticas, além do entendimento da biologia dos anuros. O presente trabalho é parte de um esforço para aumentar o nosso conhecimento acerca da diversidade de peptídeos antimicrobianos presentes nas secreções cutâneas de anuros da fauna do Cerrado brasileiro. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTSkin secretion of anurans are recognized as a rich source of several bioactive substances. An important group of such compounds are the antimicrobial peptides (AMPs). AMPs are components of the innate immune system present in the most living beings that have been awaken to an increasing interest, because they exhibit antimicrobial activity against a large array of microorganisms, being usually non-toxic for mammal cells. The aim of this study was the isolation, identification and characterization using MALDI-TOF mass spectrometry of AMPs from the cutaneous secretions of the anurans Proceratophrys goyana, Physalaemus fuscumaculatus and Physalaemus centralis, commonly found in the Brazilian Cerrado. It was also described the biological characterization of two synthetic versions of the ceratoxinlike peptide previously isolated and chemically characterized from the frog Hypsiboas albopunctatus. The skin secretions were obtained by electrical stimulation, freeze-dried and stored at -20ºC. Each crude secretion was fractioned by RP-HPLC on a C18 column (Shim-pack CLC-ODS, 6.0 x 150 mm) using a HPLC system and employing a linear gradient of TFA 0,1% (v/v) in acetonitrile. The detection was monitored at 216 nm and the elution was performed at 1 mL/min. The eluted chromatographic fractions were manually collected and dried in vacuum. Meaningful differences in the chromatographic profiles of each species were observed. All eluted chromatographic fractions were tested for their cellular proliferation inhibition of pathogenic bacteria S. aureus (ATCC 25923) and P. aeruginosa (ATCC 27853), as also for their ability to promote lysis of human erythrocytes. The bioactive fractions were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry in order to evaluate their homogeneity and to determine the molecular masses of the major components present in each fraction. Antimicrobial peptides were identified in the three secretions under analysis. The two synthetic versions of the ceratoxin-like peptide with Leu or Ile in the C-terminal region were evaluated for their inhibitory activity on the cellular proliferation of seven different Gram-positive and Gram-negative bacteria. The two versions of the ceratoxin-like peptide of H. albopunctatus exhibited strong antibacterial effects with MICs ranging from 2 to 8 M. As several AMPs of large spectrum of action are also toxic to cancer cells, these two peptides were also tested against cervix cancer cell lineage (HeLa) and fibroblasts (NIH3T3). The results indicated that the two peptides were cytotoxic for both tested cells (cancer and normal cells). Bioprospective studies related to the chemical and biological characterization of the compounds present in the skin secretions of anurans are extremely relevant, as they can help clarifying taxonomy issues, on the development of therapeutic drugs, and also on the understanding of amphibian biology. This work is part of an effort to increase our knowledge about the diversity of antimicrobial peptides present in the skin secretions of the anurans from the Brazilian Cerrado fauna