Avaliação da transcrição, expressão e indução de genes que codificam peptídeos antimicrobianos em Hypsiboas raniceps por ferramentas de biologia molecular e espectrometria de massa

O presente trabalho descreve um modelo experimental que permite avaliar as alterações nos níveis de transcrição de RNAs, síntese e processamento de peptídeos presentes nas secreções cutâneas de anfíbios. A partir deste modelo, foram utilizadas ferramentas de biologia molecular em associação com técnicas de obtenção de imagens moleculares por espectrometria de massa, com o objetivo de avaliar como Hypsiboas raniceps reage a um modelo experimental no qual anfíbios são submetidos a diferentes tipos de estresses (bióticos e abióticos). A utilização das técnicas de biologia molecular conjugadas a imagens de íons moleculares por espectrometria de massa permitiu as análises dos níveis de transcrição de diversos genes, assim como da síntese dos peptídeos codificados a partir destes, em uma mesma região do tecido animal. Os resultados sugerem que a aplicação do estímulo elétrico (estresse abiótico) promove um aumento imediato dos níveis de transcrição dos genes e seus respectivos peptídeos antimicrobianos em H. raniceps o qual se estende por até 36 horas, período no qual as glândulas granulares tornam-se carregadas de peptídeos novamente e os níveis de transcrição voltam a diminuir. De forma análoga aos dados anteriores, a presença de micro-organismos (Estresse biótico) na pele de H. raniceps parece estimular o sistema imune inato de defesa ao promover o aumento dos níveis de transcrição dos genes que codificam peptídeos antimicrobianos. Sob condições experimentais complementares às anteriores, anfíbios submetidos ao contato tópico com os antibióticos, oxacilina, gentamicina e ampicilina, apresentaram níveis de expressão gênica superiores àqueles dos anfíbios que foram expostos unicamente a micro-organismos. O modelo experimental proposto apresenta-se como uma estratégia alternativa para estudos de análise da expressão diferencial de peptídeos em tecidos biológicos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe present work describes a strategy for in situ identification of antimicrobial peptides present in frog skin, their respective RNA transcription levels and peptide synthesis variation analysis. The chosen experimental model is based on molecular biology and imaging mass spectrometry (IMS) techniques to investigate the antimicrobial peptide skin composition of Hypsiboas raniceps when the anuran is submitted to biotic and abiotic stress. Under a mild electrical shock stimulation high transcriptional levels of RNA encoding antimicrobial peptides can be observed for 36 hours, only after that antimicrobial peptides ions are detected by IMS experiments whereas the transcriptional levels decrease. When the animals are exposed to pathogenic microorganisms (biotic stress) there is an evident increase in gene expression levels leading to a corresponding increment on antimicrobial polypeptide content in the skin. In a complementary experiment, frogs were washed with an antibiotic solution, containing oxacillin, gentamicin and ampicilin. Under this conditions superior RNA expressions levels than the previous experiments were observed suggesting that the microorganism-based molecules that composed the antibiotic solution may have triggered the defense mechanism more efficiently. The experimental model introduced here represents an alternative strategy for differential gene expression analysis and peptides identification directly on biological tissue