Quality assessment of bovine sperm cryopreserved after sex sorting by flow cytometry and its use on in vitro embryo production

Estudos utilizando sêmen sexado por citometria de fluxo têm demostrado uma menor fertilidade deste quando comparado ao não sexado. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade estrutural e funcional da célula espermática após sexagem por citometria de fluxo. Amostras de sêmen congelado de quatro touros foram utilizadas. Um ejaculado de cada touro foi coletado e fracionado em três partes, sendo: não sexado (NS), contendo espermatozóide sexado X (SX) e Y (SY). Uma palheta de sêmen foi descongelada sendo uma amostra retirada para avaliação da cinética espermática por sistema computadorizado (CASA computer-assisted semen analysis), aglutinação de cabeça, alterações morfológicas, integridade das membranas plasmáticas e acrossomal, capacitação espermática e integridade da cromatina. O restante foi depositado em gradiente de Percoll de 90:45% (NS90) ou 60:45% (NS60, SX e SY). Após centrifugação em gradiente de Percoll, o pellet resultante foi homogeneizado, sendo utilizado para avaliação espermática ou PIV. Cada procedimento foi repetido três vezes em manipulações diferentes. Para PIV, 2271 ovócitos maturados in vitro foram utilizados, sendo avaliada taxa de fecundação por coloração lacmóide 18 horas pi, clivagem avaliada em D2 (48 hpi) e a taxa de produção de blastocisto avaliada em D6, D7, D8 e D9 de cultivo. Os dados foram analizados usando procedimento GLIMMIX do programa SAS(R) (p < 0,05). Nas características espermáticas avaliadas antes ou após a passagem pelo gradiente de Percoll, nenhuma diferença foi observada entre os grupos SX e SY para todas as variáveis estudadas. As avaliações realizadas antes e após a passagem pelo gradiente de Percoll mostraram que o sêmen não sexado apresentou maior motilidade, maior porcentagem de células com membrana íntegra e células vivas com acrossoma intacto do que o sêmen sexado. Foi observado um efeito do gradiente de Percoll nas amostras de sêmen não sexado, sendo que aquelas submetidas ao gradiente de 90:45% apresentaram maior motilidade, maior porcentagem de células com membrana intacta e menor taxa de recuperação do que as submetidas ao gradiente de 60:45%. Para taxa de fecundação não foi encontrada diferença entre os grupos. O grupo NS90 apresentou maior taxa de clivagem do que o grupo SY, enquanto que os grupos NS60 e SX foram semelhantes aos demais. A taxa de produção de blastocisto dos dias 6, 7, 8 e 9 de cultivo foi maior no grupo NS90 do que no NS60, SX e SY. Com relação à cinética de desenvolvimento embrionário, não foi observado diferença entre os grupos no estágio do embrião nos dias 6, 7, 8 e 9 pi. Os resultados indicam que o processo de sexagem afeta as características espermáticas, mas não causa diminuição da fertilidade in vitro. No entanto, a diferença nas taxas de blastocisto entre os grupos NS60 e NS90 indica que há um efeito do protocolo de seleção espermática na produção de embriões. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTSeveral studies using sex-sorted sperm by flow cytometry have shown that sexed sperm has lower fertility than the non-sexed. Therefore, the objective of the present study was to evaluate structural and functional characteristics of sperm sexed by flow cytometry. In addition, in vitro embryo production and development was assessed when sexed and non-sexed sperm were used for in vitro fertilization. Frozen sexed and non-sexed semen from four sires were used. One ejaculate from each bull was obtained and separated into three portions, being non-sexed (NS), sexed for X (SX) and sexed for Y (SY). Frozen-thawed semen from each sample was analyzed for motility by computer-assisted semen analysis (CASA), sperm head agglutination, sperm morphology, plasma membrane integrity, acrosome integrity, capacitation and chromatin integrity. Then, the samples were placed in 90:45% (NS90) or 60:45% (NS60, SX e SY) Percoll gradient. After Percoll centrifugation, the pellet was used for sperm analysis or IVF. All sperm quality tests and IVF experiments were repeated three times in independent replicates. For IVF a total of 2271 in vitro matured oocytes were used. To assess fertilization rate presumptive zygotes were fixed and stained with lacmoid at 18 hpi. Cleavage was evaluated at D2 (48 hpi) and blastocyst at D6, D7, D8 and D9 of culture. Data were analyzed using proc GLIMMIX of SAS(R) (p < 0.05). No differences were observed between SX and SY groups for any of the sperm variables evaluated either before or after Percoll centrifugation. The evaluations performed before and after Percoll treatment showed that non-sexed sperm had higher motility, higher percentage of cells with intact membrane and higher percentage of live cells with intact acrosome than sexed sperm. An effect of Percoll gradient was observed in the non-sexed samples, with those submitted to 90:45% gradient presenting higher motility, higher percentage of cells with intact membrane and lower recovery rate than those submitted to a 60:45% gradient. No differences among groups were observed for fertilization rate. NS90 group showed higher cleavage rate than the SY group, while groups NS60 and SX had similar rates to the others. Blastocyst rates at D6, D7, D8 and D9 of culture was greater for group NS90, and similar among NS60, SX and SY groups. Regarding embryo development kinetics, all groups showed similar developmental stages on D6, D7, D8 and D9. The results suggest that although the sex-sorting procedure by flow cytometry affected sperm characteristics, it did not cause a decrease on in vitro fertility. In addition, differences in blastocyst rates between groups NS60 and NS90 indicated an effect of sperm selection protocol on embryo production