Análise estrutural e funcional da região promotora do gene quitina sintase 4 de Paracoccidioides brasiliensis

O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica com maior prevalência na América Latina. A patogenia deste fungo parece estar diretamente ligada ao processo dimórfico. A expressão diferencial de genes é essencial em diversos processos biológicos como resposta ao estresse, diferenciação celular, interação hospedeiro-patógeno, entre outros. P. brasiliensis, é capaz de sobreviver e se replicar no interior dos macrófagos do hospedeiro. Nesse sentido, genes ortólogos a potenciais fatores de virulência de outros microrganismos patogênicos são encontrados em P. brasiliensis. Nesse contexto, esse trabalho analisa a regulação do gene quitina sintase 4 (CHS4), responsável pela polimerização da quitina, um polímero que atua na biosíntese da parede celular. Visando a análise da função promotora do gene CHS4, um fragmento de DNA contendo a região promotora deste gene foi clonado e transformado em A. nidulans utilizando o gene repórter lacZ. Os transformantes foram cultivados em meios contendo diferentes fontes de carbono. Os resultados sugerem que o precursor de quitina, Nacetilglicosamina, ativa o promotor de CHS4. Também foi realizada uma busca por regiões consenso a sítios de ligação para fatores de transcrição. Foram encontrados vários sítios para fatores de transcrição diversos e selecionado uma região que continha um elemento consenso ao sítio de ligação a PacC e dois sítios consenso para STRE. Para essa região foi sintetizado um oligonucleotídeo utilizado como sonda para o experimento de retardo de mobilidade eletroforética (EMSA). Os resultados do EMSA sugerem uma interação DNA-proteína específica em ambas as fases e outra interação micélio específica. Esses resultados nos mostram que a região utilizada como sonda pode estar atuando na regulação transcricional do gene CHS4, mas ainda são dados insuficientes para determinar qual proteína está interagindo com a região promotora deste gene. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of the paracoccidioidomycosis, the major systematic mycosis prevalent in Latin America. This fungus is able to survive and replicate in the interior of the host macrophages, and its pathogenesis seems to be directly correlated with its dimorphism for which differential gene expression is essential. The differential gene expression is also crucial in different biological processes such as stress-response, cellular differentiation, host-pathogen interactions, and others. Furthermore, orthologs genes to potential virulence factors in other pathological microorganisms are found in P. brasiliensis. In this context, this work analyses the regulation of chitin synthase 4 (CHS4), responsible for the polymerization of chitin - a polymer which acts in the biosynthesis of the cellular wall. In the attempt to analyse the promoter function of the CHS4 gene, a DNA fragment containing the promoter region of this gene was cloned and transformed in Aspergillus nidulans, using lacZ as the gene reporter. The transformants were cultivated in broth containing different sources of carbon. The results from these experiments suggest that the chitin precursor, N-acetylglucosamine, activates the promoter of CHS4 gene. A search for consensus regions to transcriptional factors’ binding sites was also performed and assorted sites for diverse transcriptional factors were found. A region which contained a consensus element to the binding site of PacC and two consensus sites for STRE was selected for further investigation. An oligonucleotide, for this region, was synthesized to be used as a probe for the electro mobility shift assay (EMSA). The results suggest two specific protein- DNA interactions, one in both phases and another peculiar to the mycelium phase. This would suggest the region used as a probe may act in the transcriptional regulation of the CHS4 gene; nevertheless the results so far are insufficient to determine which protein is interacting with the promoter region