Use of actinomycin D as a chemical enucleation method of bovine oocytes destined for nuclear transfer

A clonagem por Transferência Nuclear (TN) é uma técnica pouco eficiente e laboriosa. O processo, do ponto de vista técnico, é um dos principais fatores responsáveis pela quantidade e qualidade dos embriões produzidos. A enucleação é a etapa mais agressiva da TN. Apesar dos métodos alternativos propostos, a enucleação permanece sendo realizada como inicialmente descrita nos anos 50. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do inibidor irreversível de transcrição e replicação actinomicina D (Fluka®, Suiça) como método de enucleação química de ovócitos. Ovócitos foram maturados in vitro (MIV) por 4 ou 6 horas e expostos a actinomicina D (T1, controle; T2 = 1,0 μg ml-¹ / 16hs; T3 = 1,0 μg ml-¹ / 14hs; T4 = 2,5 μg ml-¹ / 14hs; T5 = 5,0 μg ml-¹ / 14hs). Os ovócitos foram desnudados após 20 horas de MIV e ativados com 24-26 horas de MIV. As taxas de clivagem foram avaliadas 48 horas após a ativação (D2) e as de blastocisto após 168 (D7) e 192 (D8) horas de cultivo. Parte dos ovócitos foi fixada e corada com lacmóide ou orceína para determinação da fase da meiose ou para visualização da morfologia dos cromossomos, respectivamente. Posteriormente, ovócitos tratados com actinomicina D foram utilizados para clonagem por TN, sendo que parte dos embriões (D3) foi fixada para avaliar o percentual de células apoptóticas através do teste de TUNEL. Os dados relativos às taxas de maturação, clivagem e blastocisto foram analisados pelo teste do Qui-quadrado e os percentuais de apoptose pelo teste de Mann-Whitney. A taxa de maturação (T1 = 90,4%; T2 = 82,3%; T3 = 79,1%; T4 = 83,4%; T5 = 74,7%), clivagem (T1 = 68,9%; T2 = 46,0%; T3 = 49,7%; T4= 33,4; T5= 29,3%) e de blastocisto em D8 (T1 = 41,1%; T2 = 1,4%; T3= 1,3%; T4= 0,9%; T5= 0,0%) após o tratamento com actinomicina D foi significativamente menor. Dos ovócitos fixados, 63,2% estavam em metáfase II (MII). Ao avaliar os cromossomos, foi observada uma descondensação significativa com as concentrações mais altas (2,5 e 5,0 μg ml-¹). Os demais tratamentos não apresentaram modificações perceptíveis. Ovócitos tratados com 1,0 μg ml-¹ por 14 horas foram utilizados como citoplasmas receptores. A taxa de clivagem dos embriões reconstruídos (61,3%) foi semelhante ao grupo partenogenético tratado (61,3%) e inferior ao não tratado com actinomicina D (70,2%), embora a taxa de blastocisto tenha sido mais alta no grupo de TN (11,8%) em relação ao controle tratado (3,6%) e inferior ao controle sem tratamento (38,0%). Ao analisar o índice apoptótico dos embriões, os embriões partenogenéticos tratados tiveram um índice maior que os partenogenéticos não tratados (24,2% contra 4,8%). No entanto, os embriões oriundos de TN com ovócito tratado não foram diferentes estatisticamente dos TN controle (9,3 contra 13,0%). A actinomicina D é eficiente no bloqueio da transcrição e replicação embrionária. Além disso, foi possível obter embriões reconstruídos que apresentavam percentual de células apoptóticas indistinguível do controle. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACTCloning by Nuclear Transfer (NT) is a low efficiency and labor intense technique. The process, in technical terms, is one of the main factors responsible for both embryo quality and quantity. Enucleation is the most aggressive step. Although alternative methods have been proposed, it remains mainly as it has been first described in the early fifties. The objective of the present work was to evaluate the effect of transcription and replication inhibitor actinomycin D as a chemical enucleation method for oocytes. Oocytes were matured in vitro (MIV) for 4 or 6 hours and exposed to actinomycin D (T1, control; T2 = 1,0 μg ml-¹ / 16hs; T3 = 1,0 μg ml-¹ / 14hs; T4 = 2,5 μg ml-¹ / 14hs; T5 = 5,0 μg ml-¹ / 14hs). The oocytes were denuded 20 hours after MIV and activated 24-26 hours after MIV. The cleavage rate was recorded 48 hours post activation and the blastocyst at 168 (D7) and 192 (D8) hours of culture. Some oocytes were fixed and stained with lacmoyd or orcein to determine the maturation status or for chromosome morphology evaluation, respectively. Furthermore, oocytes treated with actinomycin D were used as recipient cytoplasts for NT, while some embryos (D3) were fixed to evaluate the percentage of apoptotic nuclei by the TUNEL assay. The data relative to the maturation, cleavage and blastocyst rate were analyzed by the chi-square test and apoptosis percentages by the Mann-Whitney test. The maturation (T1 = 90,4%; T2 = 82,3%; T3 = 79,1%; T4 = 83,4%; T5 = 74,7%), cleavage (T1 = 68,9%; T2 = 46,0%; T3 = 49,7%; T4 = 33,4%; T5 = 29,3%) and blastocyst rate at D8 (T1 = 41,1%; T2 = 1,4%; T3 = 1,3%; T4 = 0,9%; T5 = 0,0%) after actinomycin D treatment was significantly different. Analyzing the fixed oocytes, 63,2% were in MII. While evaluating the chromosomes, it was observed a significant uncoiling when exposed to higher concentrations (2,5 and 5,0 μg ml-¹). The remaining groups had no apparent perceptible modifications. Furthermore, oocytes treated with 1 μg ml-¹ for 14 hours were used as recipient cytoplasts. The cleavage rate (61,3%) was similar to the actinomycin D treated control group (61,3%) and lower than the non-treated control (70,2%), although the blastocyst rate was higher in the NT group (11,8%) comparing to the treated control (3,6%) and lower to the untreated control (38,0%). After analyzing the embryos for apoptotic cells, the treated parthenogenetic embryos had a higher index than the parthenogenetic control (24,2% vs. 4,8%). However, the NT embryos generated by treated cytoplasts wasn’t statistically different from the NT control (9,3 vs. 13,0%). The actinomycin D treatment is efficient to block embryonic transcription and replication. Moreover, it was possible to obtain reconstructed embryos that possess an apoptotic cell index indistinguishable from the control