Produção in vitro de embriões : cultivo de embriões pós-eclosão e criopreservação de meios prontos para uso

Taxas de blastocisto aceitáveis são obtidas com os sistemas atuais de produção in vitro de embriões. Entretanto, o elevado índice de reabsorção embrionária e descontinuidade de gestação, bem como as variações dos resultados obtidos, diminuem de forma significativa a eficiência da técnica. Na tentativa de minimizar estes dois fatores foi focado nesta tese o desenvolvimento de novas formas de monitoramento dos embriões e simplificação da rotina diária. O primeiro trabalho, desenvolvido para o monitoramento do desenvolvimento embrionário, procura aprofundar o entendimento das perdas embrionárias no período de reconhecimento materno da gestação. Apesar de inúmeras investigações do desenvolvimento e caracterização embrionárias serem constantemente realizadas, estas estão restritas ao embrião até 7 dias de vida ou à gestação avançada. A maioria dos problemas, no entanto, está concentrada no período de reconhecimento materno, seguido da implantação no endométrio, sendo imprescindível a criação de métodos práticos e confiáveis que permitam o monitoramento do desenvolvimento embrionário pós-eclosão. Diante dessa necessidade, foi estabelecido um sistema de cultivo in vitro de embriões bovinos no período pós-eclosão denominado sistema PHD (post hatching development). Nele, embriões produzidos in vitro foram cultivados em túneis de gel de agarose em meio de cultivo modificado e os dados obtidos revelaram que o sistema de cultivo foi capaz de sustentar a diferenciação celular do embrião em trofoblasto, hipoblasto e epiblasto, inclusive com a formação da camada de Rauber, definindo assim o disco embrionário. Este sistema de cultivo representa o primeiro modelo experimental capaz de promover crescimento e diferenciação pós-eclosão in vitro, podendo ser utilizado com sucesso para monitorar o efeito tardio de tratamentos utilizados no sistema de cultivo. Dados preliminares de seu uso para monitorar substâncias tóxicas e expressão gênica foram obtidos e estão relacionados no corpo desta Tese. Adicionalmente ao sistema PHD, um segundo trabalho focou a simplificação e maior padronização da rotina da produção in vitro de embriões, sugerindo para isto, o congelamento e estoque de meios de cultivo prontos para uso. Os resultados obtidos com meios congelados em dois sistemas distintos de produção in vitro (DIAS-Dinamarca e Embrapa- Brasil), mostraram ser possível a produção de embriões em meios previamente congelados, sem que haja prejuízo nas taxas de blastocisto alcançadas. Além de facilitar a laboriosa rotina de produção de meios de cultivo, seu congelamento e estoque permitiram a existência de padronização entre manipulações, dado que a partida dos meios de cultivo utilizados é sempre a mesma. Em conclusão, os dois trabalhos desenvolvidos nesta Tese, um de contribuição científica e o outro aplicado, procuram contribuir em áreas pouco exploradas e deixam claro que existem lacunas a serem investigadas para melhoria dos sistemas atuais da produção in vitro de embriões. ________________________________________________________________________________ ABSTRACTAcceptable blastocyst rates are obtained with the actual systems of in vitro embryo production. However, the high rate of embryonic death and gestation interruption, as much as the broad variation in the obtained results, reduce significantly the technique efficiency. In a trial to minimize both factors, this thesis has focused on developing new monitoring systems and routine work simplification. The first work was developed for monitoring embryo development, in an effort to understand embryos loss in the maternal recognition of pregnancy period. Although several investigations have been focused in embryo development and characterization, these are restricted to the embryo up to 7 days, or to the late gestation. However, most of the problems are concentrated in the maternal recognition period, followed by endometrium implantation, so it is fundamental to create practical and trustable methods for monitoring the post-hatching embryo development. Considering this necessity, a post-hatching culture system denominated PHD (Post Hatching Development) system was established. In this system, in vitro produced embryos were cultured in agarose gel tunnels under a modified culture medium and the obtained data revealed that it was capable to sustain embryonic cell differentiation in trophoblast, hypoblast and epiblast, including the Rauber´s layer formation, defining the embryonic disc. This represents the first complete experimental model to promote rapid growing and post-hatching differentiation in vitro, able to be successfully used to monitor the late effect of treatments in the culture system. Preliminary data of its use to monitor toxic substances and gene expression were obtained and are described in this thesis. Additionally to the PHD system, a second work focused on the simplification and pattern of in vitro embryo production. For that, we suggested the freezing and stocking of ready-to-use medium. The results obtained in two different systems (DIAS-Dinamarca and Embrapa- Brasil) have shown that it is possible to produce embryos in previously frozen medium without affecting embryo rates. Besides facilitating the laborious routine of medium production, freezing aliquots has allowed to create a pattern among different manipulations, considering that the medium batch was always the same. In conclusion, both works developed in this thesis, one more scientific and the other more applied, try to contribute in non explored areas and clearly show that there are gaps to be investigated for enhancing the results in in vitro embryo production