Produção, armazenamento, estabilidade e eficiência de linhagens de Dicyma pulvinata no biocontrole para o mal-das-folhas da seringueira

Dicyma pulvinata é um micoparasita encontrado em diferentes áreas geográficas do Brasil e em outros países, porém ainda pouco estudado. Esse fungo apresenta potencial para biocontrole do mal-das-folhas da seringueira, doença causada por Microcyclus ulei, que vem limitando a produção de látex e a implantação de novos seringais, especialmente nas regiões úmidas do Brasil e da América Latina. O presente trabalho teve por objetivo a realização de estudos sobre D. pulvinata, buscando o desenvolvimento de uma tecnologia de uso massal desse agente de biocontrole. Para tanto, avaliou-se o efeito de diferentes substratos, dos métodos de produção, regimes de luz, temperatura e das fontes nutricionais no crescimento e esporulação do antagonista, bem como, métodos de secagem e armazenamento dos esporos produzidos. Estudou-se, ainda, a compatibilidade do fungo com agrotóxicos e o efeito da adição de adjuvantes ao inóculo. Quatro linhagens do micoparasita foram avaliadas sob condições de campo. Finalmente, instabilidade genética de duas linhagens de D. pulvinata mantidas em coleção, após repicagens sucessivas, foi determinada através das técnicas moleculares RAPD e RFLP. O método mais eficiente para produção de D. pulvinata em larga escala foi o de cultivo em sacos de polipropileno, utilizando arroz parboilizado como substrato. As fontes de carbono glicose e sacarose foram responsáveis pelo maior crescimento das colônias, enquanto a sacarose e o amido elevaram a esporulação do fungo. Em arroz parboilizado não houve diferença entre testemunha e as fontes de carbono. Sulfato de amônio destacou-se entre as fontes de nitrogênio testadas. Fotoperíodos de 0 e 6 horas de luz promoveram maior crescimento micelial do fungo e luz contínua favoreceu a esporulação das linhagens avaliadas. Com relação à temperatura, observou-se que o fungo cresce, esporula e germina entre 19 e 25 ºC. Nos experimentos de secagem, três dias em dessecador foi o período mais adequado. Na germinação, com seis horas de incubação a 25 ºC obtiveram-se mais de 90 % de esporos germinados. Com relação ao armazenamento, o período de esporos viáveis após estocagem revelou ser curto, mostrando a necessidade de se desenvolver preparações formuladas. Resultados obtidos com o Biodac mostraram que esse material poderá se constituir em alternativa como suporte para cultivo e veiculação do hiperparasita. A ação do D. pulvinata em campo foi comprovada, destacando-se as linhagens CEN 62 e CEN 93 com controle semelhante ao fungicida. O agente de controle demonstrou incompatibilidade com os agrotóxicos avaliados, exceto com Malathion. Quanto ao efeito da adição de adjuvantes às suspensões de esporos do antagonista, não houve inibição do crescimento e esporulação, indicando que qualquer um desses produtos poderia ser usado como componente de um formulado à base de esporos de D. pulvinata. No que se refere aos estudos relativos à estabilidade desenvolvidos com duas linhagens de D. pulvinata, verificou-se que este fungo, quando mantido em meio de cultivo e após cultivos sucessivos, apresenta alterações morfológicas de colônias, caracterizadas por formação de setores. Alterações genéticas também foram evidenciadas pelos diferentes padrões de bandas obtidos nas análises de RAPD e RFLP. Neste trabalho foram estabelecidas às condições ideais de produção e armazenagem, a eficiência em campo e a estabilidade genética de linhagens de D. pulvinata, que certamente irá contribuir para o estabelecimento de uma tecnologia de uso do D. pulvinata como agente de biocontrole para o mal-das-folhas da seringueira. __________________________________________________________________________________ ABSTRACTDicyma pulvinata is a mycoparasite found in different geographic areas of Brazil and in other countries; however, it is still little studied. This fungus shows potential for the biocontrol of South American Leaf Blight of the rubber tree, Hevea brasiliensis, caused by Microcyclus ulei. This disease severely limits latex production and restricts the development of new plantations in the humid regions of Brazil and Latin America. The objective of the present work was to study D. pulvinata, to develop technology for massproduction of this biocontrol agent. In this way, the effect of different substrates, production methods, regimes of light, temperature and nutritional sources in the growth and sporulation of the antagonist was evaluated, as well as methods of drying and storage of the produced spores. The compatibility of the fungus with agrotoxins as well as the effect of the addition of adjuvant to inoculum was also studied. Four strains of the mycoparasite were evaluated under field conditions. Finally, genetic instability of two strains of D. pulvinata from our collection was determined after successive replications using the molecular techniques, RAPD and RFLP. The method found to be most efficient for large-scale production of D. pulvinata was culture in polypropylene bags, using parboiled rice as substrate. The carbon sources glucose and sucrose allowed the fastest growth of the colonies, while sucrose and starch improved the sporulation of the fungus. In parboiled rice, additional carbon sources produced no difference from the control while ammonium sulphate was the most favourable among the tested nitrogen sources. Photoperiods of 0 and 6 hours of light promoted greater mycelial growth of fungus and continuous light favoured sporulation. In relation to temperature, it was observed that the fungus grows and germinates between 19 and 25 ºC. In spore drying experiments, three days in a desiccator was the optimum period. In the germination tests, with six hours of incubation at 25 ºC, 90 % of spores germinated. In storage, spores after harvest were found to be to be short-lived, indicating the necessity of developing formulated preparations. Results obtained with Biodac showed that this material is a viable alternative as support for culture and propagation of the hyperparasite. The action of D. pulvinata in the field was proven, where strains CEN 62 and CEN 93 had similar control levels to the usual fungicide. The control agent, however, demonstrated incompatibility with the evaluated agrotoxins, except with Malathion. The addition of adjuvants to the suspensions of spores of the antagonist did not inhibit growth and sporulation, indicating that any one of these products could be used as a component in the formulations of spores of D. pulvinata. Studies on the stability of two strains of D. pulvinata, showed that this fungus readily presents alterations of colonial morphology, characterized by the formation of sectors. Strains producing sectors were shown to possess genetic alterations as evidenced by variations in bands obtained in RAPD and RFLP analyses. In this work, methods of production and storage have been optimised, the efficiency in field and the genetic stability of D. pulvinata strains demonstrated. These data may then contribute to the establishment of the use of D. pulvinata as an agent of biocontrol for leaf blight of rubber