Purificação parcial e caracterização de uma alfa-galactosidase de sementes de Guapuruvu (Schizolobium parahyba)

Uma das principais características da soja como alimento, é o seu alto teor de proteínas. Todavia a soja e, consequentemente, seus derivados, apresentam carboidratos (oligossacarídeos de rafinose: RO) que limitam seu consumo, causando restrições quanto ao seu uso na alimentação em função dos sintomas desagradáveis. Tais açúcares são, portanto, considerados fatores anti-nutricionais. A redução dos teores desses açúcares não digeríveis é de grande importância para a ampliação da utilização da soja. A redução dos teores dos RO poderá ser conseguida por meio da adição das enzimas α-galactosidases [α-D-galactosil galactohidrolases (E.C. 3.21.22)] ao processamento dos derivados de soja. Essas enzimas, hidrolisam a ligação α-1,6 que une o resíduo de galactose ao de glicose, produzindo galactose e sacarose livres, açúcares facilmente hidrolisados in vivo e absorvidos. Alfa-galactosidases são produzidas por diferentes organismos, entre estes estão leguminosas que produzem alfa-galactosidades durante a germinação das sementes para mobilizar o material de reserva contido no cotilédone. A alfa-galactosidase da semente de Guapuruvu, uma planta nativa da mata atlântica, foi parcialmente purificada com índice de purificação de 148 vezes e rendimento de 1,4%. A atividade máxima da alfagalactosidase foi detectada em pH 5,5 e 45°C. A enzima manteve 50% da atividade original após incubação por 150 minutos a 40°C. O KM para pNPGal foi de 1,68 mM e o VMAX foi de 0,18 μmol.min-1.mL-1. A atividade enzimática desta enzima foi inibida por FeCl3 ZnSO4, CuSO4, CaCl2, SDS, MnCl2, AlCl3, HgCl2, CuCl2, CoCl2 e AgNO3. A enzima não apresenta atividade de transglicosilação. Espectrometria de massa foi utilizada para determinar a massa molecular da enzima. Populações de proteína com valores de massa molecular de 20.179 kDa e 11.543 kDa foram encontrados, além de um possível peptídeo com massa molecular de 6.724 kDa. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTOne of the main characteristics of the soy as food, is its high protein content. However the soy and, consequently, its derivatives, present carbohydrates (raffinose oligosaccharides: RO) that limit its consumption, causing restrictions to its use in the feeding in function of undesirable symptom, like the flatulence following ingestion of these soybean sugars. Due to the absence of α1-,6 galactosidase in the intestinal mucose which is required to hydrolyze the undesirable sugar. Such sugars also known as raffinoseoligosaccharides (ROs) are therefore, considered as anti-nutrient factors. The reduction of amount of these indigestible sugars is of great importance to increase the use of soybean. The reduction of RO in soybean and in its derivatives may be obtained by means of the addition of α-galactosidases enzymes [α-D-galactosil galactohidrolases (E.C. 3.21.22)] to the soybean derivatives preparation. These enzymes, hydrolise the α- 1,6 linkages that join the residue of galactose to the glucose present in the ROs, producing free galactose and sacarose, sugars that are easily hydrolyzed in vivo and absorbed. Alpha-galactosidase is produced by different organisms, among them, appears those plants that produces alpha-galactosidades during the germination of the seeds which is required to mobilize the material of reserve contained in the cotyledon. The alpha-galactosidase in the seed of a native plant of the Atlantic Forest, Guapuruvu, was partially purified with a purification factor of 148 times and yelding of 1,4%. Maximal activity of the alpha-galactosidase were detected at pH 5,5 and 45°C. The partially purified enzyme retained about 50% of the original activity after incubation for 150 minutes ate 40°C. KM values of 1,68 mM and VMAX values of 0,18 μmol.min-1.mL-1 were determined for conversion of pNPGal by algorithm for determination for non linear parameters. The alpha-galactosidase activity was substancially inhibited by FeCl3 ZnSO4, CuSO4, CaCl2, SDS, MnCl2, AlCl3, HgCl2, CuCl2, CoCl2 and AgNO3. The enzyme did not show, transglicosilation activity. Mass spectrometry was performed to determine the molecular mass. The partially purified alpha-galactosidase preparation contain at least 3 proteins with molecular mass of 20,179 kDa e 11,543 kDa and 6,724 kDa