Construção de vetor baculoviral modificado capaz de produzir proteínas fusionadas à poliedrina

Este trabalho objetivou construir um vetor baculoviral modificado capaz de expressar proteínas heterólogas fusionadas à poliedrina e à cauda de hexahistidina e utilizar esse vetor para expressão e purificação da proteína capsidial de vírus do complexo viral do alho. Via PCR, foi sintetizado o fragmento PH (gene da poliedrina fusionado a uma cauda de hexa-histidina). Entre a poliedrina e a cauda de histidina foi inserido um sítio de NcoI. Na primeira tentativa de obtenção do fragmento PH, em vez do gene da poliedrina, a reação de PCR amplificou uma parte do genoma de Escherichia coli. Na segunda tentativa de obtenção do fragmento PH, o gene da poliedrina foi amplificado, contudo foi verificado que havia um erro no “primer” 5’ utilizado, que gerou alteração da fase do fragmento PH. Somente na terceira tentativa (reação de PCR) o fragmento PH correto foi obtido. O fragmento PH foi clonado no vetor pFastBac1 (Invitrogen), gerando o vetor pFastPH. Um baculovírus recombinante vAcPH expressando a proteína PH foi construído via transposição sítio-específica utilizando o kit “Bac-to-Bac” (Invitrogen). Foi realizada análise da expressão de proteínas de células Tn5B infectadas com vAcPH (72 hpi). SDS-PAGE mostrou presença de uma proteína de peso molecular superior ao da poliedrina nativa e compatível com o esperado para a proteína PH. Western Blot mostrou que essa proteína é reconhecida tanto por anticorpo contra a poliedrina quanto por anticorpo contra a cauda de hexahistidina. Além da obtenção do fragmento PH correto, também foram sintetizados, via PCR, genes da capa protéica (de vírus presentes no complexo viral do alho:GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV) flanqueados por sítios de NcoI. Esses genes foram comprovados por análise do padrão de restrição. Futuramente, tais genes poderão ser clonados no pFastPH para gerar baculovírus recombinantes expressando uma proteína de fusão “poliedrina + proteína capsidial + cauda de hexa-histidina” que poderá ser utilizada para produção de anticorpos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACTThe present work goal was the production of a modified baculovirus vector capable of expressing an heterologous protein fused to the polyhedrin and to an hexahistidin tag. The PH fragment (polyhedrin gene with an NcoI site and a histidin tag at its 3’ end) was synthesized through PCR reaction. In the first attempt to obtain the PH fragment, instead of the polyhedrin gene, PCR reaction amplified a fragment of Escherichia coli genome. In the second attempt, the problem was the 5’ “primer”, which had an extra nucleotide and disrupted the PH fragment reading frame. In the third attempt, the correct PH fragment was obtained and cloned into pFastBac1 vector (Invitrogen), generating pFastPH. A recombinant baculovirus (vAcPH) expressing the PH protein was obtained through site-specific transposition (“Bac-to-Bac” kit, Invitrogen). SDS-PAGE showed the presence of a protein with molecular weight (MW) superior to the native polyhedrin MW (28,6 KDa). In Western Blot experiment, PH protein was recognized by antibody against polyhedrin and by antibody against hexahistidin tag, proving that the PH protein was being expressed. Also, this work attempted to use the modified baculovirus vector to express and purify the capsid protein of viruses present in the garlic virus complex (GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV). NcoI sites were added, through PCR, to both ends of these genes. In the future, these genes these genes may be cloned in pFastPH vector to generate baculovirus expressing these virus coat proteins fused to the PH gene. The purified fusion proteins may then be used in experiments to obtain antibodies against them