Caracterização bioquímica e citolocalização de uma Serina/Treonina Fosfatase – PP2C de Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas apresenta o Trypanosoma cruzi como seu agente etiológico. Ao longo de seu ciclo de vida complexo, o parasita possui quatro formas principais de desenvolvimento: epimastigota, tripomastigota metacíclico, tripomastigota sanguíneo e amastigota. As manifestações clínicas da doença podem ser divididas em três fases: aguda, fase crônica indeterminada e fase crônica digestiva e/ou cardíaca. As formas de transmissão podem ser vetorial, por transfusão sanguínea, doação de órgãos sólidos, por alimentos e bebidas contaminados e outros. Atualmente o tratamento baseia-se nos medicamentos Benzonidazol e Nifurtimox. Existem diversas classes de proteínas implicadas na diferenciação celular e dentre elas podemos destacar as fosfatases. Para este trabalho foram propostas a clonagem, a expressão heteróloga, a purificação em coluna de Agarose/Níquel2+, a citolocalização em diferentes formas evolutivas e a caracterização bioquímica da proteína Serina/Treonina fosfatase- PP2C. A proteína TcPP2C foi expressa, na sua forma recombinante, na fração solúvel (3h a 20°C). Purificamos a proteína recombinante, sendo a TcPP2C eluída em uma concentração de 20-30mM de Imidazol. Testes de atividade enzimática para a TcPP2C com o substrato p-nitrofenilfosfato mostraram a proteína ativa somente na presença de íons divalentes, em maior grau na presença de manganês em comparação com magnésio. A enzima apresenta maior atividade na presença de DTT e a pH 7,5. Os ensaios de imunofluorescência indicam uma localização pontual da TcPP2C na forma epimastigota, difusa em amastigota e não identificada em tripomastigota. Esses dados experimentais mostraram que a enzima recombinante possui as características bioquímicas da subfamília PP2C importante para a sinalização celular, e que a nativa está presente nas formas de vida replicativas do T. cruzi. TcPP2C poderia estar principalmente envolvida nas vias de sinalização da divisão celular e da amastigogênese. __________________________________________________________________________ ABSTRACTChagas disease presents Trypanosoma cruzi as its etiological agent. During its complex life cycle, the parasite has four main forms of development: epimastigote, metacyclic trypomastigote, blood trypomastigote and amastigote. The clinical manifestations of the disease can be divided into three phases: acute, indeterminate chronic phase and digestive and / or cardiac chronic phase. The forms of parasite transmissions can be by vector feces, blood transfusion, solid organ donation, contaminated food and drinks and others. Currently, the disease’s treatment is based on the drugs Benznidazole and Nifurtimox. There are several classes of proteins implicated in cell differentiation and among them we can highlight the phosphatases. For this work, we proposed the initial study of a serine / threonine protein phosphatase- PP2C from T. cruzi – TcPP2C. The enzyme was cloned, expressed in a heterologous system and purified on a column of Agarose / + Níquel2 for further tests. Its citolocalization was determined at different developmental forms of the parasite and some biochemical features of the enzyme was proposed. The TcPP2C protein was expressed active in the soluble fraction of the bacteria (3h at 20 ° C). TcPP2C enzymatic activity tests with the substrate p-nitrophenyl phosphate was carried out in the presence of divalent ions, to a greater extent in the presence of manganese compared with magnesium. TcPP2C enzymatic activity is dependent of DDT and is optimal at pH 7.5. Immunofluorescence assays indicate a specific location of TcPP2C in the epimastigote form, diffuse location in the amastigote and it was not identified in trypomastigote forms. These experimental data showed that the recombinant enzyme has the biochemical characteristics of the subfamily PP2C. In a general way, this protein is important for cell signaling, and since it is present in native forms of replicative life of T. cruzi, TcPP2C could be primarily involved in signaling pathways and amastigogenesis