Avaliação do metabolismo da adenosina em um modelo de síndrome alcoólica fetal em zebrafish (Danio rerio)

A exposição ao etanol durante as fases iniciais de desenvolvimento embrionário pode causar alterações morfológicas e comportamentais, mesmo quando ingerido em baixas doses. Retardo no crescimento, microcefalia e retardo mental são algumas das características observadas em crianças portadoras da SAF (síndrome alcoólica fetal), cujas mães ingeriram etanol durante a gestação. Os mecanismos pelos quais o etanol afeta o desenvolvimento embrionário e causa tais alterações ainda não foram completamente desvendados. O aumento extracelular da adenosina após exposições crônicas e agudas ao etanol indica que o sistema purinérgico tem um importante papel nesses mecanismos. A adenosina é um neuromodulador que atua através da ativação de receptores metabotrópicos do tipo P1 (A1, A2A, A2B e A3) e pode agir como um neuroprotetor endógeno. No espaço extracelular, a adenosina pode ser produzida pela hidrólise sequencial da adenosina trifosfato (ATP) realizada pela cascata das ectonucleotidases, uma família de enzimas localizada na superfície celular, sendo o processo chave – hidrólise da adenosina monofosfato (AMP) à adenosina – realizada pela ecto-5’- nucleotidase. A utilização do peixe-zebra em estudos toxicológicos e de desenvolvimento oferece uma série de vantagens. Seu tamanho e a forma de criação permitem a manutenção de uma grande quantidade de peixes em um espaço relativamente pequeno. O cruzamento resulta em um grande número de ovos e o desenvolvimento ocorre rapidamente, e progride através de etapas bem definidas.Estudos recentes têm empregado o peixe-zebra como modelo para a síndrome alcoólica fetal e demonstrado que a exposição embrionária ao etanol resulta em fenótipos comparáveis com aqueles observados em outros modelos vertebrados. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel do metabolismo da adenosina nos parâmetros morfológicos e locomotores de larvas de peixe-zebra expostas ao etanol. Os resultados obtidos demonstraram que além dos danos morfológicos já conhecidos, há alteração na atividade enzimática da ecto- 5’-nucleotidase em larvas de 7 dias, em ambos os tratamentos, agudo e crônico, de uma forma independente da expressão gênica, que por sua vez, não foi alterada. O tratamento prévio com AOPCP, um inibidor da ecto-5’-nucleotidase, não foi capaz de prevenir os danos morfológicos de forma relevante, embora estatisticamente verificou-se uma leve prevenção. O pré-tratamento com dipiridamol, um bloqueador do transporte de adenosina, piorou ainda mais os efeitos causados pelo etanol. Considerando as mudanças que ocorrem nos níveis extracelulares de adenosina após exposições ao etanol e o envolvimento do sistema purinérgico em estágios iniciais do desenvolvimento, nossos resultados sugerem que existe uma ação combinada da enzima ecto-5’-nucleotidase e dos transportadores de nucleosídeos nesta elevação dos níveis extarcelulares de adenosina, com ênfase na inibição dos transportadores de nucleosídeos. Adicionalmente, podemos inferir que há uma correlação entre a elevação dos níveis de adenosina e os defeitos morfológicos característicos da exposição ao etanol. Tais resultados sugerem que o sistema purinérgico é um alvo para os efeitos tóxicos induzidos pelo etanol nas fases iniciais do desenvolvimento.The ethanol exposure during early embryonic development can cause morphological and behavioral changes even when ingested in low doses. Growth retardation, microcephaly and mental retardation are some of the features observed in children with FAS (fetal alcohol syndrome) whose mothers ingested ethanol during pregnancy. The mechanisms by which ethanol affects embryonic development and cause such changes have not been fully elucidated. The increase in the extracellular adenosine levels after chronic and acute exposure to ethanol indicates that the purinergic system has an important role in this situation. Adenosine is a neuromodulator that acts through the activation of metabotropic receptors type P1 (A1, A2A, A2B and A3) and can act as an endogenous neuroprotector. In the extracellular space, adenosine can be produced by sequential hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) held by ectonucleotidases, a cascade of a family of enzymes located on the cell surface, which the key process to hydrolyze to adenosine is performed by ecto-5'-nucleotidase. The use of zebrafish in toxicology studies and development offers a number of advantages. Its size and breeding allow the maintenance of a large quantity of fish in a relatively small space. The production of a large number of eggs and the development occurs rapidly, and progresses through well-defined steps. Recent studies have employed the zebrafish as a model for fetal alcohol syndrome and demonstrated that embryonic exposure to ethanol results in phenotypes comparable to those observed in other vertebrate models.The objective of this study was to evaluate the role of adenosine metabolism in the morphological and locomotor parameters of zebrafish larvae exposed to ethanol. The results showed that in addition to morphological damage already known, there is a change in the enzymatic activity of ecto-5'-nucleotidase in larvae of seven days, in both treatments, acute and chronic, independent of gene expression form, which in time was not changed. Pre-treatment with AOPCP, an inhibitor of ecto-5'- nucleotidase, was unable to prevent the morphological damage in a relevant way, although statistically there was a slight prevention. Pre-treatment with dipyridamole, an adenosine transport blocker further worsened the effects caused by ethanol. Considering the changes that occur in extracellular levels of adenosine after exposure to ethanol and the involvement of the purinergic system in early stages of development, our results suggest that there is a combined action of the enzyme ecto-5'-nucleotidase and nucleoside transporters in this rising of extracellular adenosine levels, with emphasis on the inhibition of nucleoside transporters. Additionally, we can infer that there is a correlation between elevated levels of adenosine and morphological defects after exposure to ethanol. These results suggest that the purinergic system is a target for the toxic effects induced by ethanol in the early stages of development