Alterações nas proteínas de fissão e fusão mitocondriais, caspase 3 e sinaptofisina cerebrais induzidas pela sobrecarga de ferro neonatal: reversão pelo tratamento com canabidiol

O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Previamente, mostramos que a sobrecarga de ferro no cérebro resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. Devido à elevada taxa metabólica do sistema nervoso, as mitocôndrias estão presentes em grande número em células nervosas. Tem sido demonstrado que, por meio da fissão e fusão, essas organelas promovem alterações na sua estrutura e essa dinâmica pode afetar a função mitocondrial e vice-versa. Déficits no fornecimento de energia para as sinapses têm sido associados a doenças neurodegenerativas e com a redução da funcionalidade de circuitos neurais essas células podem ativar cascatas de morte neuronal. No presente trabalho, foram analisados os efeitos do tratamento do ferro neonatal sobre os seguintes alvos: proteína 1 semelhante à dinamina (DNM1L) e proteína atrófica óptica 1 (OPA1), envolvidas na regulação de fissão e de fusão mitocondrial, respectivamente; caspase 3, uma protease essencial da fase efetora da apoptose; e sinaptofisina, um marcador sináptico. Além disso, nós investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, já mostrado capaz de melhorar a memória de ratos tratados com ferro, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre as proteínas DNM1L, OPA1, caspase 3 e sinaptofisina. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal. Na idade adulta, foram tratados com veículo ou CBD (10mg/kg) durante 14 dias.Os níveis proteicos e a expressão gênica no hipocampo e córtex foram quantificados através de Western blotting e RT-qPCR, respectivamente. A quantificação das proteínas foi realizada através da medida das densidades das bandas individuais, normalizadas pela densidade de β-actina. Para o RT-qPCR, as amostras foram normalizadas para 3 genes de referência (GAPDH, HPRT1 e RPL13A). Os resultados da análise protéica indicaram que o tratamento com ferro no período neonatal induziu redução de DNM1L no hipocampo e OPA1 no córtex. O ferro também aumentou os níveis de caspase 3 tanto no hipocampo quanto no córtex, acompanhado por redução dos níveis de sinaptofisina no hipocampo. O CBD reverteu os efeitos induzidos pelo ferro, trazendo os níveis hipocampais de DNM1L, caspase 3 e sinaptofisina de volta aos valores comparáveis ao grupo controle. Os resultados sugerem que o ferro pode afetar a dinâmica mitocondrial, possivelmente desencadeando perda sináptica e morte celular por apoptose. A reversão desses efeitos pelo CBD indica o seu potencial efeito neuroprotetor.Iron accumulation in the brain has been observed in both normal aging and in several neurodegenerative diseases. We have previously shown that brain iron loading results in persistent memory deficits, which are accompanied by oxidative stress. Due to the high metabolic rate of the nervous system, mitochondria are present in large numbers in nerve cells. It has been demonstrated that through fission and fusion of mitochondria, these organelles promote changes in their structure and this dynamic can affect mitochondrial function and vice-versa. Deficits in supplying energy to the synapses have been linked to neurodegenerative diseases and once the functionality of neural circuits is reduced, these cells may activate neuronal death cascades. Here, we analyzed the effects of neonatally iron treatment on the following targets: Dynamin-1-like protein (DNM1L) and Optic atrophy 1 (OPA1), proteins involved in regulating mitochondrial fission and fusion, respectively; Caspase 3, a key protease of the effector phase of apoptosis; and Synaptophysin, as a synaptic marker. Additionally, we investigated the effects of Cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, previously shown to improve memory in iron-treated rats, in reversing iron-induced effects on DNM1L, OPA1, caspase 3, and synaptophysin. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30mg/kg) at postnatal days 12-14. At adulthood, they were treated with vehicle or CBD (10 mg/kg) for 14 days.Hippocampal and cortical protein levels and gene expression were quantified using western blotting analysis and RT-qPCR, respectively. Quantitative measurements of proteins were made using densities of individual proteins, normalized to the density of β-actin. On RT-qPCR, samples were normalized to three reference genes (GAPDH, HPRT1 and RPL13A). Western blotting results indicated that neonatal iron treatment induced a significant reduction of DNM1L in the hippocampus and OPA1 in the cortex. Iron was also shown to increase caspase 3 both in the hippocampus and cortex, which was accompanied by a significant reduction of synaptophysin levels in the hippocampus. CBD reversed iron-induced effects, bringing hippocampal DNM1L, caspase 3 and synaptophysin levels back to values comparable to the control group. The present results suggest that iron may affect mitochondrial dynamics, possibly trigging synaptic loss and apoptotic cell death. The reversion of these effects by CBD, indicates its potential neuroprotective effect