Avaliação da fosfoglicerato mutase de Schistosoma mansoni como potencial antígeno imunoprotetor e identificação de novos alvos para teste de diagnóstico e vacina contra esquistossomose.

A esquistossomose é uma doença parasitária causada por parasitos do gênero Schistosoma. Apesar das tentativas de controle e introdução do tratamento com praziquantel, a doença persiste. Desse modo, o desenvolvimento de uma vacina poderá contribuir para o controle da doença. Dentre outras evidências, o alto nível de proteção alcançado pela vacinação com cercárias irradiadas em camundongos e a presença de indivíduos naturalmente resistentes à infecção por Schistosoma mansoni em áreas endêmicas sugerem a existência de mecanismos que induzem proteção contra esquistossomose. Por meio de experimentos de Western-blotting bidimensional utilizando soro de indivíduos de área endêmica para esquistossomose e extrato proteico de vermes adultos, selecionamos a proteína fosfoglicerato mutase de S. mansoni (SmPGM) para ser testada em ensaios de imunização em camundongos, uma vez que spots correspondentes a esta proteína foram reconhecidos pelo soro de indivíduos naturalmente resistentes à infecção e também porque análises in silico do seu potencial antigênico indicaram que SmPGM é uma das proteínas de S. mansoni que mais possuem peptídeos antigênicos. A região codificadora do gene foi inserida em vetor de expressão em células de mamíferos e após certificar a expressão da proteína por Western-blotting usando anticorpo anti-His (C-term) e extrato proteico de células HEK 293T transfectadas, outra construção de DNA similar, que não expressa a proteína em fusão com 6xHis, foi usada nos ensaios de imunização gênica em camundongos. Entretanto, não houve redução no número de vermes adultos recuperados de camundongos vacinados e desafiados, bem como no número de ovos liberados nas fezes e retidos no fígado e intestino. Além disso, não houve alteração na ovoposição das fêmeas, nem no número e tamanho dos granulomas. A imunização gênica não foi capaz de induzir resposta humoral, resposta imune celular e produção de citocinas. Sendo assim, foram realizados experimentos de imunização de camundongos com dois peptídeos sintéticos de SmPGM, que também não resultou em proteção pelos parâmetros analisados. Este projeto também teve como objetivo identificar proteínas de membrana, principalmente do tegumento do parasito. Para isso, um extrato proteico de vermes adultos de S. mansoni enriquecido com proteínas de membrana foi obtido e também utilizado em experimentos de Western-blotting bidimensional. Foram detectados spots proteicos que reagiram diferencialmente aos pools de soro de indivíduos de área endêmica para esquistossomose. Entretanto, todos os spots imunorreativos foram submetidos à identificação por espectrometria de massas.The schistosomiasis is a parasitic disease caused by parasites of genus Schistosoma. Even with the attempts to control the disease and the introduction of the treatment with the praziquantel drug, the disease persists. Thereby, the development of one long lasting protection, based in vaccine therapy, would be a great benefit for the disease control. Among others evidences, the high protection level achieved by vaccination with irradiated cercarie in mice and the presence of naturally resistant individuals to infection by S. mansoni in endemic areas suggest the existence of mechanisms that induce protection against schistosomiasis. By the two-dimensional Western-blotting experiments using pool of serum of individuals from schistosomiasis endemic area and adult worm protein extract, we selected the protein S. mansoni phosphoglycerate mutase (SmPGM) to be tested in immunization assays in mice, since your corresponding spots were recognize by the pool of serum of naturally resistant individuals to infection and also because in silico analysis of its antigenic potential indicated that SmPGM is one of the S. mansoni proteins that have more antigenic peptides. The codion region of the corresponding gene was inserted into a plasmid vector for gene expression in mammalian cells and after ensuring the protein expression by Western blotting using anti-His (C-term) antibody and protein extract of transfected HEK 293T cells, another similar DNA construction, without the 6xHis-tag, was used to DNA immunization assays in mice. However, there was no reduction in the number of adult worms recovered from vaccinated and challenged mice, as well as in the number of eggs released in feces and retained in the liver and intestine. Furthermore, there was neither change in the female oviposition, nor in the number and area of the granulomas. The DNA immunization was not able to induce humoral, cellular immune response and cytokine production. Thus, in mice immunizations were also performed with two SmPGM synthetic peptides. This immunization protocol also resulted in lack of protective immunity against S. mansoni infection according to the analyzed parameters. This project also aimed to identify membrane proteins, mainly of the S. mansoni parasite tegument. For this, a protein extract of S. mansoni adult worms enriched with membrane proteins was obtained and also used in two-dimensional Western-blotting experiments. Protein spots that reacted differentially to the serum pools of individuals from endemic area for schistosomiasis were detected. However, all immunoreactive spots were subjected to mass spectrometry identification