Quantitative evaluation of genetically modified soya in food by real-time polymerase chain reaction: development of an event-specific method

A técnica de PCR em Tempo Real é uma poderosa ferramenta de quantificação de OGM em alimentos, mas ainda é muito influenciada por fatores como amostragem, eficiência daextração do DNA, presença de substâncias inibidoras da reação de PCR, pelo nível de degradação do DNA e pelo próprio genoma vegetal. Atualmente, a quantificação de soja GM está relativamente limitada ao uso de kits sendo um dos mais utilizados, o que tem como sequência alvo o promotor p35S. A quantificação de soja RR em matrizes complexas que possam conter esse elemento genético oriundo de outros vegetais pode resultar em falso positivos ou em níveis superestimados de OGM. O desenvolvimento de métodos evento específicos visa à quantificação dessas matrizes com maior confiabilidade. Este trabalho teve como objetivos principais o desenvolvimento de um método evento específico que tem com alvo a região de integração do p35S e o genoma da soja; a avaliação de alguns indicadores de desempenho e quantificação de duas matrizes com o método desenvolvido; a avaliação do desempenho do kit TaqMan GMO 35S Soy Detection que tem como alvo o p35S, utilizado na rotina; a determinação do conteúdo de OGM em alimentos processsados pelo kit; e a avaliação do efeito de dois protocolos de extração de DNA na reação de PCR em tempo real. Os resultados mostraram que tanto o método de extração pelo CTAB como o kit DNeasy® (Qiagen) foram eficientes na extração de DNA das amostras de diferentes graus de processamento e que as análises comparativas das curvas analíticas da amplificação da lectina e do p35S não revelaram influência significativa dos métodos de extração na eficiência da PCR em tempo real. Os parâmetros de desempenho do kit de quantificação demonstraram linearidade, eficiência e sensibilidade e LOD em torno de 0,0125% e LOQ de 0,05%.Real-Time PCR is a powerful tool for GMO quantification in food, but is influenced by factors such as sampling, DNA extraction methods, presence of PCR inhibitors, the degree of DNA degradation and by the plant genome. Currently, the quantification of GM soybean is relatively limited to the use of kits and one of the most used has as target sequence the promoter p35S. The quantification of RR soy in complex matrices that may contain this genetic element originated from other plants may result in false positives or overestimated levels of GMOs. The development of methods event specific aims at quantifying these matrices reliably. This work had as main goals the development of an event specific method targeting the p35S integration region/soybean genome; the evaluation of some performance criteria and quantification of some matrices using the developed method; the performance evaluation of the "TaqMan® GMO 35S Soy Detection kit”, targeting the p35S, used in the routine; the determination of the GMO content in foods using this kit; and the evaluation of the influence of two DNA extraction methods on the real time PCR. The results showed that either the extraction method by CTAB or DNeasy® kit (Qiagen) were efficient providing DNA from samples with different degree of processing, and the comparative analysis of lectin and p35S calibration curves did not reveal significant influence of the DNA extraction method on real time PCR efficiency. The performance criteria of the TaqMan® GMO 35S Soy Detection kit indicated linearity, efficiency and sensitivity, LOD around 0.0125% and LOQ of 0.05%. Analysis of food samples revealed GMO contents ranging from 0.05 to 1% in 63.2% and more than 1% in 36.8% of samples. The event specific method developed for the quantification of RR soybeans was linear, showed PCR efficiency ranging from 86% to 109%, accuracy in quantifying the number of copies of the MRC from 3.6% to 12.7%, and the Cts values were highly reproducible. The results of the quantification of GMO content in samples of biscuit, mixture of flours and MRC 0.5%, using the primers and probes designed, demonstrated accuracy of the developed method indicating that studies should be continued with other matrices with different contents of RR soy for further validation. This method will enable the differential quantification between RR soybeans and the two others events of soybeans tolerant to ammonium glifosinate herbicide, approved in Brazil, since the method used in INCQS is based on the amplification of p35S, used in the construction of these three events