Análise funcional do regulador transcricional Rv3405c em Mycobacterium bovis BCG

Em 2011 foram notificados quase 9 milhões de novos casos de tuberculose (TB), culminando em aproximadamente 2 milhões de mortes. A vacina atual contra tuberculose (BCG) apresenta eficácia variável na proteção de adultos contra a tuberculose pulmonar (0% - 80%), com isso destacamos a necessidade de maiores investigações sobre a vacina. A cepa da vacina utilizada no Brasil é a BCG Moreau. Este trabalho incide sobre a caracterização de Rv3405c, um regulador transcricional (repressor) presente em todas as cepas de BCG, porém truncado em BCG Moreau devido à perda da região genômica RD16. Analisamos por RT-PCR a expressão de genes adjacentes a rv3405c em BCG Pasteur e Moreau, comprovando que sua perda funcional afeta a expressão de rv3406, que codifica uma proteína envolvida no metabolismo do enxofre. O aumento da expressão de rv3406 em BCG Moreau pode representar um ganho funcional, devido à perda desse repressor transcricional (Rv3405) A fim de caracterizar melhor a sua função, rv3405c de BCG Pasteur e rv3406 de BCG Moreau foram clonados e expressos em E. coli. O soro policlonal produzido em camundongos imunizados contra a proteína purificada rRv3406 foi utilizado para analisar sua expressão sob diferentes condições de crescimento. Rv3406 é encontrada na fração intracelular e na superfície de BCG Moreau, não tendo sido detectado em BCG Pasteur. Rv3405c recombinante purificada foi usada no ensaio de retardo em gel (EMSA), confirmando a sua capacidade para se ligar a um motivo de DNA conservado, identificado na região intergênica entre rv3405c-rv3406, sugerindo seu papel na regulação destes genes e justificando a expressão constitutiva de rv3406 em BCG Moreau. Além disso, a adição de bile e seus componentes provoca o deslocamento da proteína desfazendo sua interação com DNA. A caracterização de rv3405c e suas funções é importante para uma análise de genômica funcional comparativa entre BCG Moreau e Pasteur. Este trabalho contribui para uma melhor compreensão da vacina brasileira contra a tuberculoseTuberculosis (TB) was responsible for almost 9 million new cases in 2011, culminating in approximately 2 million deaths. The current approved TB vaccine (BCG) presents variable efficacy in adult protection against pulmonary TB (0%-80%), highlighting the need for further investigations on this vaccine. The vaccine strain used in Brazil is BCG Moreau. This work focuses on the characterization of Rv3405c, a transcriptional regulator (repressor) present in all BCG strains but truncated in BCG Moreau due to the loss of genomic region RD16. We have analysed the expression of adjacent genes in both BCG Moreau and Pasteur by RT-PCR finding that loss of Rv3405c impacts the expression of rv3406, encoding a protein involved in sulfur metabolism. Its increased expression in BCG Moreau may represent a functional gain through the loss of a transcription repressor. In order to better characterize their function, rv3405c from BCG Pasteur and rv3406 from BCG Moreau were cloned and expressed in E. coli. The polyclonal sera produced in mice immunized with purified rRv3406 were used to follow the expression of this protein under different growth conditions. Rv3406 is found in the intracellular fraction and the surface of BCG Moreau, and was not detected in BCG Pasteur. Purified recombinant Rv3405c was used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA), confirming its ability to bind a conserved DNA motif identified in the intergenic region between rv3405c-rv3406, suggesting its role in regulating these genes and justifying the constitutive expression of rv3406 in BCG Moreau. Furthermore, the addition of bile and its components is able to displace Rv3405c from DNA. The characterization of rv3405c and its functions is important for the comparative functional genomics analysis of BCG Moreau and Pasteur. This work contributes to a better understanding of the Brazilian vaccine against TB