Influência do tamanho do inóculo de Leishmania (Viannia) braziliensis na imunopatogênese da leishmaniose cutânea experimental no modelo golden hamster (Mesocricetus auratus)

As leishmanioses são um complexo de doenças causadas por diferentes espécies de Leishmania cujas apresentações clínicas variam de acordo com a espécie do parasito envolvido na infecção e com o número de parasitos inoculados além das características imunológicas e genéticas do hospedeiro. Leishmania (Viannia) braziliensis é a principal espécie envolvida na leishmaniose tegumentar Americana (LTA) e, apesar de sua grande importância, o conhecimento de sua imunopatogênese é baseado em estudos com pacientes. Poucos estudos foram conduzidos utilizando modelos experimentais de infecção por L. braziliensis, provavelmente devido à falta de uma linhagem murina que reproduza a infecção por esta espécie. O golden hamster representa o modelo experimental mais suscetível a espécies do subgênero Viannia, porém a ausência de reagentes imunológicos específicos para este modelo limita sua utilização. Além disso, os estudos disponíveis com o modelo apresentam diferentes protocolos de infecção utilizando diversas cepas em inóculos geralmente altos, levando a diferentes cursos clínicos da doença e culminando com a visceralização do parasito. Este estudo teve como objetivo investigar o inóculo ideal de L. braziliensis, em condições padronizadas, que garanta a infecção sem levar a uma doença exacerbada e analisar os aspectos clínicos e imunopatológicos associados a cada inóculo Para isto, grupos de cinco animais, em quatro experimentos independentes, foram infectados por via intradérmica com 104, 105 e 106 promastigotas de L. braziliensis. O desenvolvimento das lesões foi acompanhado por 105 dias e então fragmentos da pele inoculada, do linfonodo drenante, do baço além de soro foram coletados para avaliação da carga parasitária, expressão de citocinas, investigação da visceralização para o baço, análise histopatológica, e dosagem de IgG anti-Leishmania. Os resultados mostraram que o tempo de surgimento das lesões foi inversamente proporcional ao tamanho do inóculo e que o tamanho final das lesões variou entre os inóculos de 104 e 105 e entre 104 e 106, sem variação entre 105 e 106. O aspecto clínico das lesões também variou com o inóculo, onde os animais inoculados com 104 apresentaram lesões mais nodulares em contrapartida aos animais inoculados com 106, com lesões mais ulceradas. Apesar da diferença no número de parasitos inoculados, a carga parasitária foi a mesma entre os três inóculos. A expressão de citocinas e a dosagem de IgG anti-Leishmania apresentaram níveis elevados em todos os grupos analisados, porém sem diferenças estatísticas entre os diferentes inóculos. A análise histopatológica revelou envolvimento inflamatório leve na pele dos animais infectados com 104 enquanto os infectados com 105 e 106 apresentaram elevado grau de dano tecidual A visceralização foi diretamente proporcional ao tamanho do inóculo, pouco frequente no inóculo de 104, acometendo a maioria dos animais infectados com 106. Portanto, verificou-se que diferentes números de parasitos no inóculo exercem influência na evolução e na apresentação clínica da doença, no tamanho final da lesão e no grau de dano tecidual, porém não exerce influência na carga parasitária e na expressão de citocinas na lesão e no linfonodo e nos níveis de IgG anti-Leishmania. Estes resultados indicam que o inóculo de 104 gera lesão mais benigna e menor comprometimento sistêmico e que a modulação da resposta imune frente a diferentes números de parasitos inoculados ocorre na fase inicial da infecção e determina o estabelecimento e a magnitude da fase crônica da doençaLeishmaniasis are complex of diseases caused by different species of Leishmania which clinical presentation varies according to involved parasite species as well as the number of parasites inoculated, immunological and genetic characteristics of the host. Leishmania (Viannia) braziliensis is the main species involved in American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) and despite its great importance the majority of current knowledge about its immunopathogenesis comes from studies in patients. Few studies were conducted using experimental models of L. braziliensis, probably due to the lack of a susceptible murine model for this Leishmania species. The golden hamster appears as the most susceptible model for species from Viannia subgenus but the absence of specific commercial immunological reagents to this animal model limits its utilization. Besides that, the available studies have different infection protocols with variances in clinical features and the number of innoculated parasites is usually high, leading to the visceralization of Leishmania. This study aimed to investigate the innoculum that ensures infection without leading to an exacerbated disease in a well standardized innocula conditions and analyse the clinical and immunopathological features associated with each one. For that, groups of five animals in four independent experiments were intradermally infected with 104, 105 and 106 promastigotes from L. braziliensis. Lesion development was accompanied for 105 days and after that skin of infected site, draining lymph node, spleen and sera were collected for evaluation of final parasite load, spleen visceralization, cytokine expression, histopathological features and levels of IgG anti-Leishmania. Our results showed that outcome of skin lesions was inversely proportional to innoculum burden and that final lesion size varied among 104 and 105 or 106 infected animals, but not between 105 and 106 ones. Clinical aspects of lesions also varied with innoculum, which 104 animals presented more nodular lesions and 106 more ulcerated lesions. Despite difference in the number of parasites inoculated, final parasite load was the same among the three innocula. Cytokine expression and levels of anti-Leishmania IgG presented high levels in all infected animals, but with no statistical differences among different innocula. Histopathological analysis revealed a mild inflammatory involvement in skin of 104 infected animals, while 105 and 106 presented elevated degree of tissue damage. Finally, visceralization was directly proportional to the innoculum burden, less frequently observed in 104 infected animals, with high spleen commitment between 106 animals. In summary, different numbers of inoculated parasites influences disease outcome, clinical presentation, final lesion size and degree of tissue damage among innocula but not final parasite load, cytokine expression and IgG anti-Leishmania levels. These results indicates that 104 inoculum generates more benign lesions and a less systemic commitment and that modulation of immune response to different parasites innoculated occurs in the early phase of infection and dictates the establishment and magnitude of the chronic phase of disease