Desenvolvimento de uma metodologia semi-automatizada para busca denovas drogas utilizando Leishmania amazonensisfluorescente

As Leishmanioses s??o doen??as negligenciadas. O tratamento dos pacientes ?? a principal medida de controle, por??m a quimioterapia das Leishmanioses apresenta dificuldades incluindo: toxicidade dos medicamentos dispon??veis, via de administra????o parenteral e resist??ncia natural de algumas cepas. O m??todo de teste de drogas cl??ssico in vitro baseado na contagem microsc??pica de macr??fagos infectados apresenta limita????es por ser laborioso, n??o automatizado e sujeito a varia????es do observador. Deste modo, a busca por novos m??todos de triagem de drogas faz-se necess??rio. O estabelecimento de m??todos semi-automatizados contribuiria para aumentar a efici??ncia da busca de novas drogas contra Leishmania. Neste trabalho, a cepa de Leishmania amazonensis (PH8) foi transfectada com a prote??na vermelha fluorescente (RFP). Os parasitos transfectados foram avaliados segundo par??metros celulares e de susceptibilidade aos f??rmacos leishmanicidas tradicionais e derivados do propranolol. Os parasitos selvagens (WT) e transfectados (RFP) foram analisados pela Citometria de Fluxo e Microscopia de Fluoresc??ncia sendo facilmente discriminados por estas t??cnicas. Em geral, n??o foram observadas diferen??as na susceptibilidade entre as cepas WT e RFP frente ??s mol??culas testadas. Os parasitos RFPs foram submetidos ao teste de drogas com posterior leitura no fluor??metro para a padroniza????o do m??todo fluorim??trico. O m??todo fluorim??trico se mostrou bastante reprodut??vel em rela????o ao m??todo cl??ssico. Entretanto, durante a padroniza????o do m??todo, mudan??as na concentra????o das drogas foram necess??rias bem como a determina????o de um ponto de corte nos valores de IC50. Este trabalho tamb??m avaliou a atividade leishmanicida dos derivados das poliaminas e complexos met??licos de lapachol utilizando-se o m??todo cl??ssico. N??o s?? os derivados do propranolol, mas tamb??m os das poliaminas e lapachol se mostraram t??xicos parac??lulas de Hepatoma humano (HepG2). Este trabalho possibilitou pela primeira vez a utiliza????o de parasitos RFPs como modelo de um teste de drogas semi-automatizado.The leishmaniasis are neglected diseases. Patient treatment is the main control measure, however leishmanisasis chemotherapy faces several problems including: drug toxicity, the administration rout and natural drug resistance. Also, the classical in vitro drug testing method, which is based on microscopically counting the number of infected macrophages is rather limited, laborious cannot be automated and is subjected to variations due to observer. For this reason, the search for new methods and establishment of semi-automated methos id necessary to improve the efficiency of new drugs discovery. In this present work, Leishmania amazonensis strain PH8 was transfected with the red fluorescent protein (RFP). Transfected parasites were evaluated for their cellular parameters and susceptibility against traditional drugs and novel propranolol derivates. Wild type (WT) and transfected (RFP) parasites were analyzed by flow citometry and fluorescent microscopy. Overall we did not observe any difference in drug susceptibility between WT and RFP parasites. RFP parasite were then submitted drug susceptibility test and analyzed by fluorimeter. The fluorimetric method showed a comparable reproducibility to the standard method. However, during experimentation, some adjustments on drug concentrations were necessary to determine IC50 threshold values. Additionally, in this work, weevaluated the activity of polyamine derivates and (metalic lapachol complexes) against leishmania by the classical method. Propranolol derivates, polymaine and metalic lapachol complexes were shown to be citotoxic as shown by HepG2 cell cultures. This work was the first to show the use of RFP parasites as a model for drug screening in a semi-automated method