Avaliação das alterações celulares induzidas pela naftopterocarpanoquinona LQB-118 em Leishmania amazonensis

As leishmanioses constituem um conjunto de doenças negligenciadas que afetam cerca de 12 milhões de indivíduos em mais de 80 países. Os medicamentos utilizados no controle da infecção estão associados à baixa eficácia, alta toxicidade, dificuldade de administração, altos custos e crescente resistência. Na busca por agentes mais eficazes, uma série de naftopterocarpanoquinonas foram projetadas e sintetizadas, das quais a LQB-118 mostrou-se a mais ativa. Esse trabalho teve como objetivo avaliar os possíveis mecanismos de ação da LQB-118 sobre Leishmania amazonensis, identificando as organelas alvo e o tipo de morte desencadeado no parasito. Alterações morfológicas foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os resultados de MEV mostraram que a LQB-118 induziu retração celular e arredondamento nas promastigotas tratadas, que tornaram-se significativamente menores. Os resultados de MET mostraram que promastigotas tratadas com 2,5μM de LQB-118 apresentaram desestruturação no complexo de Golgi e número aumentado de vacúolos no citoplasma. Promastigotas incubadas com 10μM de LQB-118 apresentaram-se com citoplasma rarefeito, compactação da cromatina, mitocôndria com matriz elétron-densa e cristas dilatadas, e protuberâncias na membrana plasmática (blebs). Ensaios realizados por citometria de fluxo mostraram que o tratamento com 5μM de LQB-118 induziu exposição de fosfatidilserina indicativa de apoptose em 30% dos parasitos. A LQB-118 induziu a perda do potencial de membrana mitocondrial (m) em 70% dos parasitos avaliados por marcação com rodamina em citometria. Essa perda do m foi confirmada por fluorimetria e mostrou ser concentração-dependente quando as promastigotas foram tratadas com 2,5, 5 e 10μM de LQB-118. O tratamento das promastigotas com 2,5, 5 e 10M de LQB-118 por 48 horas induziu fragmentação no DNA de 37%, 67% e 81% da células, respectivamente, conforme avaliado pela técnica de TUNEL. Macrófagos tratados com LQB-118 não apresentaram exposição de fosfatidilserina, perda do m, e fragmentação de DNA, mostrando que o composto age de maneira setiva sobre os parasitos. Análises realizadas por microscopia de fluorescência indicaram que esse agente também induziu fragmentação do DNA de amastigotas intracelulares de L. amazonensis, sem provocar fragmentação do DNA da célula hospedeira. Dessa forma, a LQB-118 parece provocar de maneira seletiva em L. amazonensis muitas das alterações associadas ao processo de apoptose clássico. O colapso do potencial mitocondrial do parasita pode ser um mecanismo plausível para a atividade leishmanicida da LQB-118, a partir do qual o processo de morte celular programada seria disparado.Leishmaniasis is a complex of neglected diseases that affect approximately 12 million people in over 80 countries. The drugs used in the treatment of the infection are associated with low efficacy, high toxicity, difficult administration, high costs and increasing resistance. In the search for more effective agents, a series of naphthopterocarpanquinones were designed and synthesized, of which LQB-118 was the most active. This study aimed to evaluate the possible mechanisms of action of LQB-118 on Leishmania amazonensis, identifying the target organelles and the type of death triggered on the parasite. Morphological changes were evaluated by both scanning (SEM) and transmission (TEM) electron microscopy. SEM showed a clear parasite retraction and rounding, with a significant reduction in size. TEM revealed Golgi complex disruption and increased number of vacuoles in the cytoplasm of promastigotes treated with 2.5μM LQB118. Promastigotes incubated with 10μM LQB-118 had scarce cytoplasm, chromatin condensation, mitochondria with electron dense matrix and disrupted cristae, and blebs on the plasm membrane. Assays by flow cytometry showed that the treatment with 5μM LQB-118 induced phosphatidylserine exposure indicative of apoptosis in about 30% of parasites. The LQB-118 induced loss of m in 70% of the parasites stained with rhodamine as evaluated using cytometry. This loss of m was confirmed by fluorimetry and showed to be dose dependent when the promastigotes were treated with 2,5, 5 and 10 M LQB-118. Treatment of promastigotes with 2,5, 5 and 10M LQB-118 for 48 hours induced DNA fragmentation in 37%, 67% and 81% of cells, respectively, as evaluated by TUNEL assay. Macrophages treated with LQB-118 did not present phosphatidilserine exposure, loss in the m and DNA fragmentation, indicating that this compound acts selectively on the parasite. Analyses performed by fluorescence microscopy indicated that this compound also induced DNA fragmentation in intracellular amastigotes of L. amazonensis, but failed to induce DNA fragmentation in the host cells. Thus, LQB-118 is able to trigger in L. amazonensis promastigotes several changes associated with classical apoptosis. The collapse of mitochondrial potential of the parasite may be a plausible mechanism for the leishmanicidal activity of LQB-118, triggering the process of programmed cell death