PGD2 e inflamação eosinofílica: mecanismos moleculares e potencial como alvo terapêutico

Durante a resposta alérgica, dentre os vários mediadores inflamatórios de natureza lipídica, a prostaglandina D2 (PGD2) é considerada um mediador-chave. Em adição aos seus conhecidos efeitos quimiotáticos para eosinófilos, recentemente, foi descrito que a PGD2 é também capaz de promover a ativação dos eosinófilos, induzindo a biogênese de corpúsculos lipídicos e a síntese de leucotrieno C4 (LTC4) nessas organelas recém-formadas. Esses efeitos são atribuídos a ação da PGD2 sobre seus 2 receptores – DP1 e DP2 – os quais encontram-se expressos de maneira constitutiva na membrana dos eosinófilos. Então, o objetivo principal do estudo foi identificar o receptor específico da PGD2 envolvido no mecanismo de síntese de LTC4 por eosinófilos estimulados com PGD2. In vivo, num modelo murino de pleurisia alérgica e induzida por PGD2, a utilização dos antagonistas seletivos do receptor DP1 (BW A868c) ou do receptor DP2 (CAY10471) inibiu a síntese de LTC4 nessas respostas inflamatórias. No entanto, somente BWA868C foi capaz de inibir a biogênese de corpúsculos lipídicos nos eosinófilos recrutados para o sítio inflamatório; enquanto que o tratamento com o CAY10471, diminuiu o número de eosinófilos infiltrantes na cavidade pleural, mas não inibiu a biogênese de corpúsculos lipídicos nessas poucas células recrutadas. In vitro, eosinófilos humanos purificados estimulados com PGD2 tiveram a síntese de LTC4 inibida tanto pelo pré-tratamento com BWA868c, quanto pelo prétratamento com CAY10471. Além disso, a ativação do receptor DP1, com seu agonista seletivo (BW245c) e a ativação do receptor DP2 com o agonista seletivo do receptor DP2 (DK-PGD2) corroborou a observação de que no processo de síntese de LTC4 nos eosinófilos, ambos os receptores são necessáior, pois somente quando ambos os receptores foram ativados simultaneamente foi observada síntese de LTC4 nos corpúsculos lipídicos recém-formados (Eicosacell). Além disso, caracterizamos que uma das vias de sinalização intracelular envolvida na formação de corpúsculos lipídicos é depende da ativação de proteína quinase A (PKA). Em um outro grupo de ensaios, investigamos a PGD2 como potencial alvo terapêutico em doenças alérgicas. Recentemente, foi descrito que o extrato aquoso de C. sympodialis e a warafteína (alcalóide isolado) têm propriedades antialérgicas, visto que não somente reduzem a eosinofilia, mas também, a biogênese de corpúsculos lipídicos, assim como a produção de leucotrienos cisteinados. Dessa forma, aqui demonstramos que os pré-tratamentos tanto com o extrato quanto com o alcalóide isolado, foram capazes de inibir a produção de PGD2 ocorrida durante a resposta alérgica. In vitro, embora a warafteína não tenha inibido a biogênese de corpúsculos lipídicos em eosinófilos induzida por PGD2, observamos que é capaz de bloquear a liberação de PGD2 por mastócitos ativados – mas, não a produção de PGE2 por macrófagos ativados com A23187 – demonstrando que o mecanismo de ação dos seus efeitos antiinflamatórios não parecem envolver antagonismo de receptores em eosinófilos, e sim inibição da síntese da PGD2 em sítios alérgicos.During allergic response, among several lipid mediators produced, prostaglandin D2 (PGD2) has emerged as key mediator. In addition to its known eosinophilotatics effects, recently PGD2 was described to be able to promote eosinophil activation, inducing lipid bodies biogenesis and LTC4 synthesis within these newly formed organelles. These effects are attributed to the action of PGD2 on its 2 receptors – DP1 e DP2 – which are expressed constituvely on eosinophil cell membranes. So, the main objective of this study was to identify the PGD2 specific receptor involved in LTC4 synthesis mechanism by stimulated eosinophils with PGD2. In vivo, in a murine allergic model of pleurisy and in a pleurisy induced by PGD2, the use of selective DP1 receptor (BWA868c) and DP2 receptor (CAY10471) antagonists showed us that both treatments inhibited LTC4 synthesis during these inflammatory responses. However, only BWA868C treatment was able to inhibit lipid bodies biogenesis within recruited eosinophils to the inflammatory sites, while CAY10471, decreased the number of infiltrated eosinophils in the pleural cavity, but did not inhibit lipid bodies biogenesis within these low number of recruited cells. In vitro, pre-treatment with BWA868c or CAY10471 inhibited LTC4 synthesis by human eosinophils stimulated with PGD2. Moreover, the activation of DP1 receptor with its selective agonist (BW245c) and DP2 activation with DP2 selective agonist (DK-PGD2) reinforced the observation that during LTC4 synthesis within eosinophils, activation of both receptors are necessary, because only simultaneous activation of DP1 and DP2, induced LTC4 synthesis within eosinophilic lipid bodies (Eicosacell). Moreover, we observed that the pathway of cellular signaling involved on lipid bodies biogenesis induced by DP1 activation is dependent on protein kinase A (PKA). In another set of experiments, we investigated PGD2 as a therapeutical target of allergic diseases. Recently, it was described that aqueous extract of C.sympodialis and warafteine (isolated alkaloid) have antiallergic properties, because of its effects on the reduction of eosinophils recruitment, lipid bodies biogenesis and cysteinyl leukotrienes synthesis. Here, we demonstrated that pre-treatments with extract and its alkaloid were able to inhibit PGD2 production during allergic response. In vitro, warafteine did not inhibit eosinophil lipid bodies biogenesis induced by PGD2, but it was capable to inhibit PGD2 release by activated mast cells – otherwise fail to blockade PGE2 production by A23187- activated macrophages – suggesting that the action mechanism of its antiinflammatory effects could occur through PGD2 synthesis inhibition in allergic sites