Genotipagem de isolados de Mycobacterium leprae de pacientes hansenianos do Brasil

A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa crônica, causada pelo Mycobacterium leprae. Após o sequenciamento do genoma deste patógeno, inúmeros esforços têm sido feitos na busca por sequências repetitivas com potencial para diferenciar isolados de M. leprae. Atualmente, VNTRs têm sido utilizados com o objetivo de compreender a diversidade genética deste patógeno em áreas com alta prevalência da doença. Além disso, SNPs também têm contribuído para elucidar aspectos referentes à disseminação da hanseníase pelo mundo. Neste estudo, a variabilidade genética de 292 isolados de M. leprae oriundos de amostras clínicas de pacientes hansenianos das regiões norte, nordeste e sudeste do país foi avaliada utilizando 16 VNTRs e três SNPs. O polimorfismo dos diferentes VNTRs foi determinado através de MLVA (Multiple-locus VNTR analysis) utilizando FLA (Fragment lenght analysis), enquanto que os SNPs foram analisados através de PCR-RFLP e/ou sequenciamento. O poder discriminatório dos 16 VNTRs foi de 0.999, sendo que as repetições de dinucleotídeos AT e o trinucleotídeo GAA21 apresentaram os maiores índices de discriminação alélica. Além da genotipagem de isolados de M. leprae de biópsias de pele, material de linfa fixado em lâmina de baciloscopia também foi utilizado como uma fonte alternativa para obtenção de DNA deste bacilo. Com relação à genotipagem por SNP, foi possível observar a predominância do genótipo 3, associado à população européia, em Rondônia, Rio de Janeiro e São Paulo. Já o genótipo 4, oriundo da África Ocidental, foi predominante em Pernambuco e Fortaleza. A presença dos diferentes genótipos e sua predominância em determinadas áreas corroboram com o processo de colonização do país que se reflete na atual composição étnica da população brasileira. Com base nos perfis obtidos através dos VNTRs e SNPs, foram identificados seis grupos geneticamente idênticos: quatro do Ceará, um de Rondônia e outro formado entre amostras de Minas Gerais e São Paulo. Nenhuma associação entre os pacientes enquadrados nos grupos da região norte e sudeste do país foi estabelecida. Todavia, foi possível observar que os grupos foram formados entre indivíduos oriundos de mesmo estado ou região geográfica. Com relação aos grupos formados entre as amostras do Ceará, associações entre o gênero masculino e o local de origem das amostras foram estabelecidas com base nos genótipos de M. leprae, sugerindo que estes seriam fatores de risco para a transmissão da hanseníase. Neste estudo, também foi possível avaliar amostras de pacientes com hanseníase recidiva para quatro VNTRs e os achados sugerem que estes pacientes foram re-infectados ou que houve mudança da população bacteriana durante a recidiva da doença. Os resultados comprovam que a genotipagem de M. leprae é uma ferramenta importante na elucidação de aspectos relativos à transmissão e disseminação da doença pelo mundo.Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. After sequencing the genome of this pathogen, numerous efforts have been made to identify repetitive sequences with potential to differentiate isolates of M. leprae. Currently, VNTRs have been used in order to understand the genetic diversity of this pathogen in areas with high prevalence of leprosy. Another form of genetic polymorphism, namely single nucleotide polymorphisms (SNPs), elucidated aspects related to the spread of leprosy in the world. In this study, the genetic variability of 292 M. leprae isolates from clinical leprosy patients from the north, northeast and southeast of the country, were analyzed for composition of 16 VNTRs and three SNPs. The genetic variability of different VNTRs was evaluated by MLVA (Multiple-locus VNTR analysis) using FLA (Fragment length analysis) while the SNPs were analyzed by RFLP-PCR and/or sequencing. The discriminatory power of 16 VNTRs was 0.999 and the AT dinucleotides and the GAA21 trinucleotide demonstrated the higher rates of allelic discrimination. In addition to the genotyping of isolates of M. leprae derived from skin biopsy samples, lymph fixed in ZN slides was also used as an alternative source to obtain DNA. By SNP typing, we observed the high prevalence of genotype 3, previously associated with Europeans, in the states of Rondônia, Rio de Janeiro and São Paulo. On the other hand, genotype 4, originating from Western Africa, was predominant in Pernambuco and Fortaleza. The presence of different genotypes and their prevalence in certain areas of Brazil is in accordance to the country’s history of colonization which reflects in the current ethnic composition of the population. Based on the VNTR and SNP profiles, six identical groups of two isolates each were identified: four from Ceará, one from Rondônia and another composed of samples from Minas Gerais and São Paulo. No association between patients from north and southeast of the country was established, however, most groups were composed by patients from the same state or geographic region. When performing an analysis of genotype similarity with patient data in groups from Ceará, we observed association of male gender and place of origin with M. leprae genotype grouping, suggesting these could be risk factors for transmission of leprosy. In this analysis, patients with leprosy relapse were also analyzed for four VNTRs and the results suggest the occurrence of re-infection or of bacterial population shift during disease relapse. The results of this study demonstrate that genotyping of M. leprae is an important tool to elucidate aspects of transmission and spread of disease in the world