Caracterização bioquímica e molecular da ß-Galactosidade durante a maturação de frutos de coffea arabica

As ß-galactosidases sao uma classe de glicosil-hidrolases que atuam na parede primaria das celulas vegetais, hidrolisando residuos ß-D-galactosis de extremidades nao redutoras de ß-D galactosideos presentes em diversas moleculas biologicas. Inicialmente foi feita uma caracterizacao dos monossacarideos presentes na parede primaria do pericarpo e do endosperma de frutos de Coffea arabica em distintas fases de maturacao, identificando os polissacarideos presentes nesta regiao celular, juntamente com os provaveis carboidratos-alvo para as ß-galactosidases. Em paralelo, foi realizada uma caracterizacao molecular e bioquimica das ß-galactosidases. Foi realizada uma caracterização parcial da estrutura do seu DNA genomico, juntamente com uma analise do nivel de transcricao e da atividade bioquimica in vitro e in situ foram realizadas, identificando picos de expressao nas fases iniciais de crescimento e nos frutos completamente maduros. Por fim, visando avaliar os efeitos das ß-galactosidases na maturacao de frutos de cafe, calos embriogenicos de C. arabica foram transformados por biobalistica, utilizando a tecnica do RNA interferente, com a finalidade de obtencao de plantas geneticamente modificadas de cafeeiro para o silenciamento da expressao do gene das ß-galactosidases. Foram obtidos tres calos transgenicos crescendo em meio seletivo com glufosinato de amonio, dentre os quais dois continham o fragmento deste gene. Estes calos encontram-se em fase de formacao de embrioes somaticos e as plantulas resultantes desta regeneracao serao analisadas, a posteriori, para confirmacao da presenca dos transgenes e avaliacao dos efeitos do silenciamento do gene das ß-galactosidases sobre a maturacao de frutos de cafe.ß-galactosidases are a class of glycosyl-hydrolases that act on the plant cell primary walls, hydrolyzing ß-D-galactose at the nonreducing ends of ß-D-galactosides present in several biological molecules. Initially a characterization of the monosaccharides present in the primary wall of the pericarp and endosperm of Coffea arabica fruits at different ripening stages was performed, identifying the polysaccharides present in these regions, along with the putative carbohydrate target for the ß-galactosidase. In parallel, a molecular and a biochemical characterization of ß-galactosidase was performed. A partial characterization of ß-galactosidase genomic DNA structure, along with a transcription analysis and an in vitro and in situ biochemical activity were performed, identifying peaks of expression in the early stages of growth and in fully ripe fruit. Finally, in order to evaluate the ß-galactosidase effects on coffee fruit ripening, C. arabica calli were transformed by biolistic using RNA interference approach, in order to obtain genetically modified coffee plants with a silenced ß-galactosidase expression. Three transgenic calli growing on selective medium containing ammonium glufosinate were obtained, two of which contained the ß-galactosidase gene fragment. These calli are under embryogenic regeneration and the resulting seedlings will be further analyzed in order to confirm the presence of the transgenes and to assess of the effects of ß-galactosidase gene silencing on coffee fruit ripening