Identificação molecular e caracterização estrutural de ciclotídeo de palicourea rígida com potencial inseticida

No decorrer dos anos, ocorreram diversas descobertas de peptideos contendo uma estrutura ciclica. Entre essas moleculas, destaca-se a familia dos ciclotideos, que sao pequenos peptideos ciclicos, contendo 6 (seis) residuos de cisteina conservados, ligados por pontes dissulfeto formando uma Ligacao de Cisteina Ciclica ou gCyclic Cysteine Knoth (CCK), responsavel pela grande estabilidade na estrutura contra a degradacao termica, quimica e proteolitica. Devido a esta estabilidade, cresce gradativamente o interesse em descobrir as caracteristicas estruturais e a funcao biologica desta familia. Desta maneira, o objetivo proposto por este trabalho foi o isolamento e caracterizacao de um ciclotideo, extraido da Palicourea rigida (Rubiaceae) conhecida popularmente como bate-caixa, com atividade inseticida e hemolitica. Para o isolamento deste peptideo, folhas da P. rigida, foram trituradas com solucao extratora de diclorometano/metanol (1:1). Apos a extracao o material passou por varios processos de purificacao, entre eles cromatografia por exclusao molecular com a resina de Sephadex G10, seguida por cromatografia de fase-reversa HPLC e UFLC. A analise por espectrometria de massa (MALDI-ToF/ToF e LC-MS/MS) indicou que a massa molecular deste peptideo e de 3.278 Da. A sequencia indicou que esse peptideo e um membro da familia dos ciclotideos, pertencente aos Braceletes, chamada agora de Parigidina-br1. Alem disso, a atividade antimcrobiana de Parigidina-br1 foi avaliada contra as bacterias Gram-negativa (Escherichia coli) e Gram-positiva (Staphylococcus aureus), apresentando resultado negativo para a inibicao do crescimento destas bacterias. Este mesmo peptideo tambem foi avaliado in vivo contra larvas neonatas de Lepidoptera (Diatraea saccharalis), e in vitro contra celulas SF-9 de inseto, apresentando resultados significativos para atividade inseticida e citotoxica. Finalmente sua atividade sobre celulas de mamiferos tambem foi avaliada atraves de testes hemoliticos, sendo esta apta a causar 41 % de disrupcao de hemaceas humanas na concentracao de 39 ÊM. Em conclusao os resultados reportados aqui indicam que em um futuro proximo, a Parigidina-br1 podera ser utilizada no desenvolvimento de novos bioenseticidas.Over the years, there have been several discoveries of peptides containing a cyclic structural fold. Among these molecules the cyclotides family was reported, being composed of small cyclic peptides containing 6 (six) conserved cysteine residues, connected by disulfide bonds forming a cysteine binding cyclic structure also known as "Cyclic Cysteine Knot" (CCK), responsible for enhanced structural stability against chemical, thermal and proteolytic degradation. Due to this stability, grouving interests in discovering the structural characteristics and biological function of this family have been observed. In this way, this work aims to isolate and characterize a cyclotide from Palicourea rigida (Rubiaceae), popularly known as the bate-caixa, with insecticidal and hemolytical activities. For this, leaves of P. rigida were crushed with extraction solution dichloromethane/methanol (1:1). After extraction, the crude extract was purified in multiple steps, including size exclusion chromatography by using a Sephadex G-10 resin, followed by reverse-phase chromatography HPLC and UFLC. Mass spectrometry analysis (MALDI-ToF/ToF and LC-MS/MS) indicated that the molecular mass of Parigidina-br 1 is 3.278 Da. Moreover, the sequence clearly indicated that this peptide is a member of the family of Bracelets cyclotides, now named Parigidina-br 1. In addition, the antimicrobial activity of Parigidina-br 1 was evaluated against Gram-negative bacteria (Escherichia coli) and Gram-positive (Staphylococcus aureus) showing a negative result for inhibition the growth of these bacteria. This same peptide was also challenged in vivo against neonate larvae of Lepidoptera (Diatraea saccharalis), and against insect SF-9 cells, showing remarkable insecticide and cytotoxic activities. Finally, the peptide citotoxicity against mammalian cells was also performed; causing a 41 % of hematocrit disruption. In conclusion, the results herein reported indicate that in the near future, the Parigidina-br 1 may be used in the development of new biopesticides