Expressão de cinco diferentes proteínas de interesse farmacológico em sementes transgênicas de soja [Glycine Max L. (Merril)]

As plantas superiores representam um sistema conveniente e versátil para a produção em larga escala de proteínas heterólogas. A confirmação desse potencial tem sido demonstrada pelo sucesso comercial de sistemas de produção desses polipeptídeos, baseados na transformação genética das mais variadas espécies vegetais, resultando atualmente na produção eficiente de mais de 100 diferentes proteínas heterólogas. Uma porcentagem significativa desse conjunto de polipeptídeos recombinantes engloba aquelas cujo interesse farmacológico e terapêutico se mostra evidenciado em função das propriedades bioquímicas apresentadas por essas moléculas, tais como hormônios, fatores de crescimento, anticorpos e fatores de coagulação sangüinea. Biorreatores vegetais apresentam inúmeras vantagens em relação a outros sistemas de produção de biofármacos recombinantes, principalmente no que diz respeito à praticidade, economia e segurança, apesar de algumas limitações envolvendo homogeneidade do produto, baixa estabilidade protéica e baixos níveis de expressão ainda se mostrarem recorrentes. Dessa maneira a escolha de plantas de soja [Glycine max L.(Merril)] como veículos de expressão de biofármacos de interesse comercial visa não apenas contornar algumas dessas dificuldades como também aproveitar características extremamente favoráveis para sua utilização como biorreatores de fármacos protéicos, tais como sua baixa freqüência de alogamia, ausência de parentes silvestres no Brasil e seu potencial natural de acúmulo protéico nas sementes, através de uma estratégia de expressão tecido-específico e de endereçamento molecular desses polipeptídeos para prolongamentos dos retículos endoplasmáticos de células cotiledonares das sementes, denominados corpos protéicos. Para tanto, foram construídos diferentes cassetes de expressão em nosso laboratório contendo cinco seqüências codificadoras de biofármacos com atividade efetora em humanos e de considerável impacto social: a pró-insulina, o hormônio de crescimento e o fator IX de coagulação sangüínea humanos; e fragmentos de anticorpos anti-câncer de mama e anti-reperfusão pósisquêmica, sob controle do promotor tecido-específico de sementes da β-faseolina do feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) ― a mais abundante nas sementes de feijão; além do peptídeo-sinal da α-coixina de Coix (Coix lacrima-jobi L.), responsável pelo endereçamento dos polipeptídeos para os corpos protéicos cotiledonares. Após a clonagem dos cassetes de expressão foram obtidas diferentes linhagens transgênicas de soja através do processo de biobalística e análises moleculares e bioquímicas foram realizadas para avaliar o número de cópias dos diferentes transgenes integradas ao genoma de cada linhagem, a segregação dos transgenes em sucessivas gerações de multiplicação de sementes em casa de vegetação, os níveis de expressão dos transgenes, a cinética química de expressão ao longo do ciclo de produção de sementes e a localização subcelular do acúmulo de proteínas heterólogas nas sementes.Superior plants represent a convenient system for large-scale production of heterologous proteins. Its potential has been confirmed by the commercial success of such production systems, based on genetic transformation of a broad range of vegetable species, resulting in efficient production of more than 100 different heterologous proteins. A representative percentage of recombinant polypeptides synthesized in transgenic plants is based in molecules with pharmacological applications, such as hormones, growth factors, antibodies and coagulation factors. Plant-based bioreactors presents a series of advantages when compared with other production systems, specially in what concerns of economy, easy-hand manipulation and biosafety, besides some homogeneity, yeld-production and stability limitations. The choice for Soybean plants [Glycine max L.(Merril)] for function like expression vehicles of biopharmaceutical proteins means not only to solve such problems but to explore natural and favorable abilities presented by these organisms such as low allogamy frequency, natural absence of related plants in Brazil and its excellence in seed protein accumulation. Tissue-specific expression and protein targeting of heterologous proteins to protein bodies can maximize their accumulatin in transgenic seeds. Different expression cassettes were constructed in our laboratory, with the purpose to express five different coding sequences of social impact proteins such as the human pro-insulin, growth hormone and coagulation factor IX, and two recombinant antibodies: sc FvDIR83D4 and anti- CD18, under control of the tissue-specific β-Phaseolin promoter (the most abundant In bean seeds) and α-coixin signal-peptide (subcellular cotiledonar target sequence). After gene cloning, different soybean transgenic lines were obtained by biobalistics, and molecular and biochemical analysis were carried out to determine the copy number of transgenic sequences integrated in plant genome, transgene segregation in alternate generations, protein accumulation levels, gene expression kinetics during plant cycle and subcellular targeting