Sequenciamento do genoma completo e expressão heteróloga da capa protéica do marafivirus associado à morte súbita dos citros

A Morte Súbita dos Citros (MSC) é uma doença que causa sérias perdas econômicas nos Estados de São Paulo e Minas Gerais. Esses estados plantam cerca de 200 milhões de laranjeiras, principalmente para o processamento de suco de laranja. Até o momento mais de 4 milhões de laranjeiras foram afetadas por essa doença e a maioria delas foi erradicada ou teve severo declínio. O agente etiológico dessa doença ainda não está confirmado, mas foi sugerida a associação de um novo vírus da família Tymoviridae, gênero Marafivirus, com a MSC, chamado Citrus sudden death-associated virus (CSDaV). Para contribuir com a elucidação da etiologia dessa doença a caracterização do vírus é muito importante. Por esta razão, o genoma completo deste vírus isolado de laranjeira com MSC foi seqüenciado. O genoma do CSDaV possui 6806 nucleotídeos, excluindo-se a cauda poli(A) na extremidade 3 e codifica uma poliproteína de aproximadamente 240 kDa (p240) com motivos de seqüência similares às proteínas associadas à replicação (metiltransferase, papain-like protease, helicase e polimerase) presentes nas proteínas não estruturais de outros vírus com genoma de RNA senso positivo. A extremidade 3 da open reading frame (ORF) que codifica a poliproteína também pode codificar uma proteína do capsídeo (CP) de 22,5 kDa que é presumivelmente clivada da região C-terminal da poliproteína de 240 kDa. Uma segunda CP de 21 kDa é traduzida de um RNA subgenômico (sgRNA) localizado na extremidade 3 do genoma do CSDaV. Uma possível pequena ORF na extremidade 3 do genoma foi detectada através de análise computacional e possivelmente codifica uma proteína de função desconhecida, cuja seqüência apresenta baixa similaridade com a proteína de movimento encontrada em outros vírus da família Tymoviridae. A CP de 22,5 kDa foi expressa na levedura metilotrófica Pichia pastoris para possibilitar a sua utilização posterior como antígeno na produção de anticorpos para o diagnóstico da doença. A região CP deste vírus foi inserida no genoma da P. pastoris através do vetor pPICZαA. A CP recombinante foi expressa como proteína de fusão com uma cauda de polihistidina para posteriormente ser purificada utilizando-se resinas com afinidade a esta cauda. Através do ensaio de DIBA, foi verificado que onze clones obtidos secretaram altos níveis da proteína recombinant