Estudo de variabilidade genética de aspergillus flavus como base para o desenvolvimento de PCR multiplex para detecção de fungos produtores de aflatoxinas em castanha-do-brasil e bastanha de caju

Aflatoxinas é a denominação dada a um grupo de substâncias muito semelhantes, heterocíclicas e altamente oxigenadas, tóxicas ao homem e animais. São produtos do metabolismo secundário de fungos filamentosos das espécies Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. pseudotamarii e A. nomius, desses, apenas A. flavus e A. parasiticus são economicamente importantes. Seus metabólitos são denominados B1, B2, G1 e G2. As letras referem-se a cor que emitem (blue ou green) sob luz ultra violeta de comprimento de onda de 365 nanômetros (nm) e os números a sua toxicidade, sendo o n 1 a forma mais tóxica. As aflatoxinas são carcinogênicas, imunossupressivas, teratogênicas e genotóxicas, objeto de preocupação em todo mundo, sendo de ocorrência mais frequente nos países de clima tropical, embora também ocorram em todas as regiões, nas épocas e locais de clima quente e úmido. A castanha-do-brasil (Bertholletia excelsa H. B. K.) é o primeiro produto extrativista em importância para as comunidades que vivem na Amazônia. É um produto tipicamente de exportação, sendo que das 28.467 toneladas (t) produzidas em 2001, 20.000 t tiveram como destino a Europa e os Estados Unidos. Ultimamente, o produto vem sofrendo restrições nesses mercados devido a contaminação das castanhas por aflatoxinas, com níveis acima dos permitidos, inclusive com devoluções do produto. A técnica oficial de detecção da aflatoxina e outras micotoxinas é a cromatografia, que detecta a toxina mas não o fungo, não sendo recomendada no monitoramento da cadeia produtiva. A Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) potencialmente é uma poderosa ferramenta no combate a aflatoxina podendo ser utilizada no monitoramento de toda cadeia produtiva. É uma técnica rápida e versátil, para detecção, o organismo a priori não necessita ser cultivado, é sensível, sendo capaz de detectar moléculas de DNA alvo em uma mistura complexa sem uso de sondas radioativas. E comparada às análises por cromatografia, é uma técnica relativamente barata. Nenos de 50% dos isolados de Aspergillus flavus são de fato produtores de aflatoxinas, razão da busca de um sistema PCR multiplex baseado na investigação de variabilidades em regiões do rDNA (ITS e IGS do rRNA nuclear e no mtDNA SSU rRNA), gene da β-tubulina, marcadores RAPD e genes da via biossintética de A. flavus objetivando separar isolados produtores de aflatoxinas dos não produtores. Da amplificação com os primers universais ITS5 e ITS4 (48 isolados de A. flavus originários de castanhado-brasil e castanha de caju - Anacardium occidentale L.), sequenciamento dos fragmentos e análise das seqüências da região ITS do rDNA, obteve-se um par de primers provalvemente específico para A. flavus (ASPITSF e ASPITSR). Foram também desenhados 10 possíveis tipos diferentes de primers degenerados para genes da via biossintética da aflatoxina totalizando 26 pares de primers. A investigação de variabilidade utilizando-se marcadores RAPD (11 primers), 140 fragmentos de DNA, gerou um fenograma que dividiu os 48 isolados em 5 grupos distintos conforme hospedeira e região geográfica de origem. Mais investigações serão realizadas até a obtenção da PCR multiplex específica para A. flavus produtor de aflatoxina em castanha-do-brasil e castanha-de-caju.Aflatoxins represent a group of similar heterocyclic and highly oxygenated substances, which are toxic to man and animals. Products of secondary metabolism in the filamentous fungi Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. pseudotamarii and A. nomius, the species A. flavus and A. parasiticus are of greatest economic importance. The most important aflatoxins are grouped as B1, B2, G1 and G2, with letters refering to emitted colour (blue or green) under UV light (365nm), and numbers referring to degree of toxicity. As aflatoxins are carcinogenic, imunosupressive, teratogenic and genotoxic, they are cause for concern worldwide, especially in tropical countries, as well as temperate regions with warm, humid summers. Brazil nut (Bertholletia excelsa H. B. K.) is the first extractivist product of importance for communities living in the Amazon region, and is a product principally destined for the export market, with, for example, 20000 tons of the 28467 tons produced in 2001 destined for Europe and the USA. Recently, however, exports have suffered serious restrictions, as a result of contamination of nuts with aflatoxins, with detected levels exceeding accepted levels in both markets. The official methods for detection of aflatoxins and other mycotoxins are based on chromatography, which can detect the toxin but not the mycotoxigenic fungus. Monitoring the productive chain is not currenly required, as such detection methods for toxins are relatively expensive. In order to resolve this problem, an additional method is required for detection of not only the aflatoxin, but also the aflatoxigenic fungus, applicable for monitoring the entire productive chain. Genetic variability was assessed in 48 isolates of potentially aflatoxigenic and non-aflatoxigenic isolates of A. flavus from B. excelsa and cashew nut (Anacardium occidentale L.) from different geographic regions in Brazil, with phenetic analysis of 140 DNA fragments generated with 11 RAPD primers separating isolates according to host of origin, and isolates from A. occidentale also according to geographic origin. A number of candidate PCR products for the design of primers specific to A. flavus were amplified (nuclear rDNA ITS regions, mtDNA SSU rRNA gene, and β-tubulin gene), and sequence analysis of the amplified rDNA ITS regions, together with Genbank-derived sequences for the rDNA ITS regions for other Aspergillus species and other fungal genera associated with B. excelsa and A. occidentale in Brazil, enabled the design of a potential specific primers pair ASPITSF and ASPITSR. Twenty six potential degenerate primers pairs targetting 10 genes within the aflatoxin biosynthetic pathway were also designed based upon conserved protein sequence motifs in A. flavus, A. parasiticus and A. nomius. Further research is planned for testing and adapting the designed primers in the form of a multiplex PCR system, for molecular detection of aflatoxigenic isolates of A. flavus in contaminated material