Desenvolvimento de marcadores microssatélites (SSR) em arachis hypogaea

Entre as plantas cultivadas com base genética estreita, encontra-se o amendoim da espécie Arachis hypogaea L. (Leguminosae). Esta espécie é um alotetraplóide, provavelmente oriunda por domesticação da espécie também tetraplóide A. monticola e esta por sua vez do cruzamento entre duas espécies silvestres distintas do gênero Arachis. O maior interesse pela prospecção, resgate e caracterização de germoplasma das espécies do gênero Arachis reside em seu potencial de fornecimento de genes úteis para o melhoramento do A. hypogaea, bem como na preservação da variabilidade genética populacional localizada em áreas de risco de devastação. Marcadores microssatélites são ideais para aplicações no melhoramento de plantas por sua natureza co-dominante, alto polimorfismo e conteúdo informativo. Neste trabalho foram isolados microssatélites através de metodologias de enriquecimento de bibliotecas genômicas para seqüências repetitivas contendo dinucleotídeos TC. As colônias da biblioteca foram seqüenciadas aleatoriamente não ocorrendo seleção por hibridização ou PCR-ancorado. A partir de uma biblioteca genômica enriquecida foram seqüenciados 598 clones. Essas seqüências foram processadas com o auxílio de um script Perl identificando ao total 144 seqüências com microssatélites, após análise de redundância o número de contigs abaixou para 138 e destes, apenas 77 (55%) apresentaram condições de desenhar marcadores por apresentarem tamanho suficiente de repetição e suas posições na seqüência serem adequadas para os desenhos dos pares de primers flanqueadores. Todas os cromatogramas que continham as seqüências repetidas foram previamente analisados e visualizadas com o auxílio do programa interativo Staden, cuja função foi a de organizar e verificar as sobreposições de seqüências, além de realizar a inspeção e edição manual das seqüências. Os pares de primers flanqueadores das regiões repetidas foram desenhados com o auxílio do programa Primer3. Todas as seqüências obtidas através do seqüenciamento foram analisadas posteriormente através do programa Blast-X para se verificar homologia com seqüências depositadas no banco de proteínas de Arabidopsis thaliana. Entre as 576 seqüências analisadas, 42 apresentaram homologia com algum gene, sendo destas, 13 oriundas de seqüências com regiões ricas em microssatélites. Entre as seqüências sem SSR foram encontradas homologias frequentes com retrotransposons, sugerindo abundância destes elementos no genoma de A. hypogaea.Among the cultivated plants which have suffered a genetic "bottle-neck" is included the peanut, or groundnut Arachis hypogaea L. (Leguminosae). This species is an allotetraploid possibly derived from the wild species A. monticola which, in turn, is derived from a cross between two distinct wild species of the genus Arachis. The greatest interest in the search, conservation and characterisation of wild species of Arachis resides in their potential to provide genes for the improvement of A. hypogaea through breeding. Microsatellite markers are ideal markers to be used to aid in this breeding process, because of their co-dominance, high polymorphism and high number of alleles. In this work, a genomic library enriched for TC repetitive sequences was constructed and used to obtain microsatellite containing sequences. From this library were sequenced 598 clones. The sequences were processed by the use of a Perl script to select 144 sequences with microsatellites. These 144 sequences represented 138 non-redundant sequences. Of these, only 77 (55%) were suitable for primer design and these were completed by further sequencing of the selected clones. Contigs were processed and edited using the software "Staden". Primers were designed using the program "Primer 3". Finally all 576 sequences obtained in the study (including sequences which did not contain microsatellites) were analysed by Blast-X against Arabidopsis thaliana proteins. In total 42 significant homologies were found, 13 of these being from microsatellite containing regions. Among the sequences without microsatellites significant homologies with retrotransposons were frequent, suggesting a high frequency of these elements in the A. hypogaea genome