Mechanisms involved in the anti-inflammatory zction of a polysulfated fraction from Gracilaria cornea

As algas marinhas sÃo fontes naturais de polissacarÃdeos sulfatados (PSs) detentores de diversas atividades biolÃgicas, incluindo anticoagulante, antitrombÃtica, antinociceptiva e anti-inflamatÃria. O efeito anti-inflamatÃrio dos polissacarÃdeos sulfatados totais (PSTs) da alga marinha vermelha Gracilaria cornea foram relatados anteriormente. Entretanto, seus mecanismos de aÃÃo ainda nÃo sÃo conhecidos. O presente trabalho teve como finalidade esclarecer o mecanismo de aÃÃo envolvido no efeito anti-inflamatÃrio de G. Cornea. Inicialmente, os PSTs foram extraÃdos por digestÃo enzimÃtica e em seguida, fracionados por cromatografia de troca iÃnica em coluna de DEAE-celulose, originando duas fraÃÃes (FI e FII). Foram utilizados ratos Wistar machos (180-250g) para os modelos experimentais in vivo da inflamaÃÃo. O efeito anti-inflamatÃrio da fraÃÃo FI, nas doses 3, 9 e 27 mg kg-1, foi avaliado utilizando o modelo de edema de pata induzido (s.c.) por dextrana, carragenana, histamina, serotonina, composto 48/80, bradicinina ou L-arginina e mensurado por plestismometria. AlÃm disso, foram feitos os ensaios da atividade da mieloperoxidase (MPO), anÃlise da permeabilidade vascular e anÃlise histopatolÃgica dos tecidos subplantares. Em adiÃÃo, foram realizadas anÃlises dos nÃveis da expressÃo gÃnica e proteica dos mediadores inflamatÃrios TNF-α, IL-1β e COX-2 por PCR em tempo real e imunohistoquÃmica, respectivamente. AlÃm disso, investigamos o envolvimento da via heme-oxigenase 1 (HO-1) no efeito anti-inflamatÃrio da FI. Por fim, FI foi testada localmente quanto à atividade prÃ-inflamatÃria, nas doses 3, 9 ou 27 mg kg-1; s.c. intraplantar. Os resultados mostraram que FI (3, 9 ou 27 mg kg-1, s.c.) inibiu o edema de pata induzido pela carragenana (Cg) e dextrana, como confirmados pela reduÃÃo da atividade da MPO e da permeabilidade vascular no tecido da pata, respectivamente. Na anÃlise histopatolÃgica do tecido subplantar, FI (3, 9 ou 27 mg kg-1, s.c) reduziu a migraÃÃo celular e o edema. Em adiÃÃo, FI (9 mg kg-1) inibiu em 62,8% e 64%, respectivamente, os edemas de pata induzidos por histamina e composto 48/80, mas nÃo inibiu os edemas induzidos por serotonina e bradicinina, sugerindo a participaÃÃo da histamina neste efeito. FI (9 mg kg-1) tambÃm inibiu o edema induzido por Cg em animais com mastÃcitos nÃo degranulados, mas nÃo inibiu o edema no grupo de animais com mastÃcitos degranulados pelo composto 48/80, sugerindo que a mesma estabilize membrana de mastÃcitos. AlÃm disso, FI (9 mg kg-1) inibiu em 76,2% o edema induzido por L-arginina e tambÃm diminuiu a expressÃo gÃnica e proteica dos mediadores IL-1β, TNF-α e COX-2 em relaÃÃo ao grupo Cg. Na presenÃa de Zinco Protoporfirina IX (3 mg kg-1; s.c.), FI-Gc (9 mg kg-1) perdeu sua capacidade em inibir o edema induzido por Cg, exercendo assim seu mecanismo de aÃÃo anti-inflamatÃrio atravÃs do envolvimento da via da HO-1. Com relaÃÃo ao efeito prÃ-inflamatÃrio, FI-Gc (3, 9 ou 27 mg kg-1, s.c.) foi capaz de induzir intenso edema com infiltrado de neutrÃfilos, que foi confirmada pelo aumento da atividade da MPO. No entanto, o edema induzido com a dose de 27 mg kg-1 da FI foi inibido por indometacina, dexametasona, pentoxifilina e meclizina, sugerindo assim o envolvimento de prostaglandinas, histamina e citocinas primÃrias no efeito prÃ-inflamatÃrio da FI-Gc. Logo, conclui-se que apesar da FI de G. cornea apresentar efeito prÃ-inflamatÃrio local, possui efeito anti-inflamatÃrio sistemicamente com mecanismo de aÃÃo relacionado com inibiÃÃo da histamina, estabilizaÃÃo de membrana de mastÃcitos, modulaÃÃo gÃnica e proteica dos mediadores IL-1β, TNF-α e COX-2, alÃm da ativaÃÃo da via da HO-1.Marine algae are natural sources of sulfated polysaccharides possessing several biological activities, including anticoagulant, antithrombotic, antinociceptivo and anti-inflammatory. Anti-inflammatory effects of total sulfated polysaccharides (PSTs) from the red seaweed Gracilaria cornea have been recently reported. However, their mechanisms of action are not clarified. Therefore, this study aimed to clarify some action mechanism involved in anti-inflammatory effect of G. Cornea. Initially, the PSTs were extracted by enzimatic digestion and following fractioned on DEAE-cellulose column, obtaining two fractions (FI - 0.5 M and FII - 0.75 M). Male Wistar rats (150-250g) were used in the in vivo models of inflammation. The anti-inflammatory activity was evaluated using the model of paw edema (s.c.) induced by dextran (500 μg/paw), carrageenan (700 μg/paw), histamine (100 μg/paw), serotonine (20 μg/paw), compound 48/80 (10 μg/paw), bradykinin (30 μg/paw) or L-arginina (15 μg/paw) and measured by plethysmometry. Moreover, the activity of myeloperoxidase (MPO), analysis of the vascular permeability and histological examination of the subplantar tissue were performed. In addition, was performed analysis of expression levels of genic and protein of inflammatory mediators TNF-α, IL-1β e COX-2 by qRT-PCR and immunohistochemistry, respectively. The involvement of heme-oxygenase-1 (HO-1) pathway in anti-inflammatory effect of FI was also investigated. Lastly, FI was locally injected to evaluate its pro-inflammatory activity, at doses of 3, 9 or 27 mg kg-1 per intraplantar subcutaneous (s.c.) route (i.pl.). The results showed that FI (3, 9 or 27 mg kg-1, sc) inhibited the paw edema induced by carrageenan (Cg) and dextran, as confirmed by reduced MPO activity and of the raise of vascular permeability in the paw tissue, respectively. In addition, histological examination of the subplantar tissue, FI (3, 9 or 27 mg kg-1, sc) was able to reduce cell migration and edema. In addition, FI inhibited in 62,8 and 64%, respectively, the paw edema induced by histamine and compound 48/80, but did not inhibit paw edema induced by serotonin and bradykinin, suggesting the participation of histamine in this effect. FI (9 mg kg-1) also inhibited in 76,2% the pawedema induced by L-arginine, a substrate to nitric oxide formation. Additionally, FI (9 mg kg-1, sc) inhibited the Cg-induced edema in animals with intact mast cells, but did not inhibit of those with degranulated mast cells by compound 48/80, revealing a protective role on mast cell membranes. FI down-regulated the IL-1β, TNF-α and COX-2 mRNA and protein levels, compared with Cg group. After inhibition with ZnPP IX, a specific of HO-1 inhibitor, the anti-inflammatory effect of Gc-FI was not observed in Cg-induced paw edema, suggesting thus that the anti-inflammatory effect of Gc-FI is in part dependent on the integrity of the HO-1 pathway. In relation the effect pro-inflammatory, FI (3, 9 ou 27 mg kg-1, sc) was able to induce intense inflammatory process with neutrophil accumulation, as confirmed by increase MPO activity. However, the induced edema at a dose of 27 mg kg-1 of FI was inhibited by indomethacin, dexamethasone, pentoxifylline and meclizine, suggesting the involvement of prostaglandins, histamine and primary cytokines in pro-inflammatory effect of FI. Thus, it is concluded that FI from G. cornea presents pro- and anti-inflammatory activities depending on the administration route, considered a therapeutic agent potential for future studies in inflammatory processes